| 研究課題/領域番号 |
26860022
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| 研究機関 | 大阪大学 |
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研究代表者 |
辻野 博文 大阪大学, 薬学研究科(研究院), 助教 (10707144)
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| 研究期間 (年度) |
2014-04-01 – 2017-03-31
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| キーワード | ヘムタンパク質 / 分光学的測定 / 活性酸素 / 一酸化窒素 |
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| 研究実績の概要 |
ニューログロビン（Ngb）及びサイトグロビン（Cgb）は共通して虚血に伴う障害からの細胞保護作用を有している。また、Cgbは肝線維症の抑制作用を持つことが見いだされている。そこで申請者は『新たな創薬ターゲットとなり得るNgb/Cgbの機能発現メカニズム』を明らかにすることを目的に種々アプローチを試み、Ngb/Cgbのスーパーオキサイド消去能及びONOO-産生促進能という二つの反応に着目し、1.反応メカニズム及び2.酵素活性と構造の相関関係の二つの項目に関して研究を行った。
1. 反応メカニズム解明 Ngb/Cgbの活性酸素種に対する酵素活性の詳細を明らかとすることで反応メカニズムの解明を試みた。始めに、より研究が進んでいるCgbを用いてチロシンをニトロ化する実験を試みたが、興味深いことに、ターゲットのニトロ化は観察されなかった。さらに、対象として用いたBSAと比べ、Cgbはターゲットのニトロ化を抑制し、ニトロ化から保護するという逆の役割を示した。そこで、Cgbによるニトロ化において重要となるONOO-の産生量を測定し、詳細に検討することとした。その結果、基質であるスーパーオキサイドやNOの発生条件を変更することでONOO-の産生を促進したり、逆に抑制したりするという結果が見いだされ、申請者が予測していた以上に繊細な条件によって、Cgbが活性酸素種に対して作用していることを同定した。
2. 酵素活性と構造の相関関係 Ngbをメインターゲットとし、種々の変異体における基質親和性および酵素活性と、共鳴ラマンスペクトルから観察される活性中心ヘムの微細な構造変化との関連性を調査した。これまで報告されていた基質親和性への影響のみでなく、酵素活性への影響とヘム周辺の構造変化との関係がいくつかの変異体で確認され、変異を施したアミノ酸残基が及ぼす構造変化と酵素活性との相関が強く示唆された。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
2: おおむね順調に進展している
理由
本研究は、ヒト６配位グロビンタンパク質であるNgb/Cgbについて提唱されている種々の細胞保護機能に関して、分子レベルでの反応メカニズムの解明を目的としている。申請者はNgb/Cgbと活性酸素種との関わりに着目し、その詳細を明らかとするため、申請内容に従い、以下に示すような種々の測定を行った。
まず、ニトロ化との関わりについては、当初の予定通りチロシンを用いたニトロ化の確認を行うことができた。しかしながら当初の予想とは異なり、今回用いたニトロ化の測定条件では、Cgbはチロシンのニトロ化を促進するのではなく、ニトロ化を抑制しているとの結果が得られた。この理由を探索すべく、Cgbとスーパーオキサイド、NOとの反応に関して、さらに異なる試薬による測定を行ってみたところ、Cgbはニトロ化に関わるONOO-の発生を促進する場合と抑制する場合があることを突き止めた。以上のことから、Cgbによるニトロ化反応系は当初予想していたよりも複雑なものであることを明らかとすることができた。今後、Cgbとニトロ化の関わりを、促進する条件と抑制する条件を含めて研究することで、より詳細な反応メカニズムの解明が期待できる。
また、酵素活性と構造の相関について、まずはNgbに対して行った。当初の予想通りある程度の酵素活性の低下がヘム周辺の微細な変化と連動していることが見て取れた。今後さらに変異体の数を増やすことで、活性に重要な残基の探索を行い、より詳細な酵素活性と構造の相関に関する知見を収集することが可能である。
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| 今後の研究の推進方策 |
1. 反応メカニズム解明 これまでの研究成果を踏まえ、Ngb/CgbとROSとの関係に関して、より詳細な検討を行う。これまでの知見から、Ngb/Cgbとスーパーオキサイド・NOとの反応はそれぞれ以下のスキームで起こる。
①ferric型Ngb/Cgb + O2・- → oxy型Ngb/Cgb
② oxy型Ngb/Cgb + NO → ferric型Ngb/Cgb + ONOO-
②の反応について、他のグロビンタンパク質ではONOO-はヘム上で転移が起こり、より無害なNO3-が生成することが確認されている。すなわち申請者が確認したONOO-産生の促進・抑制反応の違いは、これらの転移によるものと考えられる。そこで、②の反応の起点であるoxy型Ngb/Cgbの安定性を測定することや、ヘム上で生成する短命なONOO-を条件を検討しつつ測定することで、ONOO-産生の促進・抑制の違いを引き起こす因子の特定を行う。その後、促進・抑制因子を固定した状態でニトロ化活性の測定を再度行い、最終目標である反応メカニズムの解明へと繋げる。
2. 酵素活性と構造の相関関係 まずは、Ngbを用いてこれまでとは異なる変異体を新たに調製し、各種測定を行うことで、活性へと強く影響を及ぼすアミノ酸残基に関する情報収集を行う。また並行して、Cgbについても同様に変異体の酵素活性・基質親和性・共鳴ラマンスペクトルの測定を行い、これら二つのタンパク質から得られる情報を相互に比較することで、酵素活性と構造との相関関係を明らかにする。
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