| 研究課題/領域番号 |
26860029
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| 研究機関 | 名城大学 |
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研究代表者 |
奥田 知将 名城大学, 薬学部, 助教 (20513857)
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| 研究期間 (年度) |
2014-04-01 – 2017-03-31
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| キーワード | 自己組織化ナノ粒子 / 吸入粉末剤 / siRNA / 粒子設計 / 核酸デリバリー / 噴霧急速凍結乾燥法 / 多孔性微粒子 |
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| 研究実績の概要 |
本年度は処方最適化を目的として、ナノ粒子を構成する脂質成分や賦形剤の種類など組成を変えて噴霧急速凍結乾燥 (SFD)法により種々の粉末微粒子を調製し、水中で形成したsiRNA/脂質ナノ粒子の物性ならびに培養細胞での遺伝子発現抑制効果・細胞毒性について評価を行った。
走査型電子顕微鏡による粉末微粒子の粒子構造観察の結果から、組成による粒子構造の大きな違いは認められず、全て粒子径が約10 μmでSFD法特有の多孔性球状粒子であることを確認できた。各粉末微粒子を水に溶解して形成したsiRNA/脂質ナノ粒子の粒子径を動的光散乱法により測定した結果、カチオン性脂質とコレステロールの2成分からなるナノ粒子では平均粒子径が2.5 μm以上と大きく不均一であったのに対し、ポリエチレングリコール (PEG)脂質を加えた3成分からなるナノ粒子では平均粒子径が約100 nmと小さく均一性に優れた性質を示した。このような性質を獲得するのに、加えるPEG脂質のPEG部分の分子量が大きいほど含量が少なくて済む傾向が見られたのに対し、脂質部分の構造による大きな違いは認められなかった。ルシフェラーゼ安定発現ヒト肺癌細胞に添加した際のルシフェラーゼ発現由来の発光およびalamarBlue assay由来の蛍光をイメージング装置により検出・強度解析することで遺伝子発現抑制効果と細胞毒性をそれぞれ評価したところ、PEG脂質のPEG部分の分子量および脂質部分の化学構造によって、siRNA/脂質ナノ粒子の遺伝子発現抑制効果/細胞毒性の濃度・時間依存的作用パターンが異なることを見出した。また賦形剤の違いによる影響について同様の検討を行ったところ、遺伝子発現抑制効果・細胞毒性の評価では大きな違いが見られなかったものの、水中で形成したsiRNA/脂質ナノ粒子の粒子径評価においてマンニトールよりも疎水性アミノ酸の方がより粒子径が小さく均一なナノ粒子が得られることを明らかにした。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
2: おおむね順調に進展している
理由
調製した粉末微粒子を水に溶解して形成したsiRNA/脂質ナノ粒子の物性ならびに培養細胞での遺伝子発現抑制効果・細胞毒性の評価を通じて、『PEG脂質の種類』、『PEG脂質の含量』、『コレステロールの含量』、『N/P比 (siRNAのリン酸基に対するカチオン性脂質のアミノ基のモル比)』、『賦形剤の種類』の計5項目について、当初の計画どおりに処方最適化を達成できた点から判断した。
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| 今後の研究の推進方策 |
本年度に最適化した組成を基に調製した粉末微粒子を用いて、次年度には当初の計画通りに、『siRNA/脂質ナノ粒子による遺伝子発現抑制効果および細胞毒性の決定因子の追究』、『siRNA/脂質粉末微粒子の吸入特性の評価』、『siRNA/脂質粉末微粒子分散添加後の遺伝子発現抑制効果、細胞毒性、およびsiRNAの細部内取り込み・細胞内動態の評価 (in vitro)』の計3項目について検討していく。進行状況によっては、再来年度に計画している『siRNA/脂質粉末微粒子肺内投与後のsiRNAの体内動態および構造安定性の評価 (in vivo)』、『siRNA/脂質粉末微粒子肺内投与後の遺伝子発現抑制効果および肺障害性の評価 (in vivo)』にも着手する。
本年度の検討は水中で形成したsiRNA/脂質ナノ粒子に焦点を当てたものであるが、本研究の最終目標は粉末微粒子そのものの吸入剤応用である。呼吸器上皮細胞上での接触/溶解など粉末微粒子としての作用条件や粘液・肺表面活性物質の存在など呼吸器内特殊環境の要因から、評価系が異なる次年度以降の検討において本年度の最適組成が必ずしも適当でない可能性も十分に考えられる。
その点を考慮して、本年度得られた結果から組成を1つに絞るのではなく、効果が期待できる組成をいくつか選択して粉末微粒子を調製し、次年度以降の検討で比較する。各検討で十分な結果が得られない場合には、添加・投与量あるいは組成を変えて再度検討してみる。
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| 次年度使用額が生じた理由 |
試薬や細胞培養品の使用期限を考慮して、次年度に購入する方が適当と判断したため。
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| 次年度使用額の使用計画 |
試薬や細胞培養品など研究用の物品費に当てる。
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