研究課題
本研究課題では、細胞による非選択的取り込みであるマクロパイノサイトーシスの分子機構を明らかにすることを目的に研究を行った。先行研究によりRAW264マクロファージにおいて顕微鏡下で光照射依存的にマクロパイノサイトーシスを誘導する実験系を確立しており、本研究ではこの実験系を用い、マクロパイノゾームに集積してくる分子について解析を行った。まず、Rac1のエフェクター分子群について蛍光タンパク質GFPを融合した発現系を構築し、マクロパイノゾームへの集積の有無を検討した。その結果、これらの分子群においてマクロパイノゾームへ強く集積するものはなかった。次に、小胞輸送を制御するRabタンパク質について同様の解析を行ったところ、新規にRab10が一過的に非常に強くマクロパイノゾームに集積することが明らかとなった。また、Rab10が集積するマクロパイノゾームには、これまでにマクロパイノゾームの初期に集積することが知られているRab5の集積はみられなかった。したがって、Rab10陽性のマクロパイノゾームはこれまでに知られていない新規の取り込み経路である可能性が考えられる。また、Rab10陽性のマクロパイノゾームの特徴について共焦点レーザー顕微鏡を用いたライブセルイメージングによりで解析を行ったところ、Rab10陽性マクロパイノゾームは、大多数が形成後、5分以内に消失すること、またマクロパイノゾームからRab10陽性のtube構造が核付近に向かって伸びていくことが明らかとなった。さらにRab10の下流の分子について解析したところ、エフェクター分子の一つEHBP1およびその結合分子であるEHD1がRab10陽性のtube構造に局在することが明らかとなった。以上の結果より、マクロパイノサイトーシスにおいてRab10陽性の新規の取り込み経路の存在が示唆された。
2: おおむね順調に進展している
初年度の研究計画にあげた、3項目(1) Rac1の光活性化制御タンパク質PA-Rac1を用いたエフェクター分子の解析、(2)光活性化制御Cdc42を用いた実験、(3)新規光活性化制御タンパク質の確立のうち(1)および(2)については予定通り進めることができ結果を得ている。しかしながら、(3)については、光活性化制御タンパク質を融合したRabタンパク質の構築を行うも光照射による制御を行うことができず、光活性化制御タンパク質とRabタンパク質の繋ぎ方などにさらなる改善が必要であり、実験系の確立に至っていない。(1)の項目に関連して、マクロパイノサイトーシスに関与する分子として新規にRab10を見いだした。このRab10陽性のマクロパイノサイトーシスは全く新しい様式のマクロパイノサイトーシスの経路である可能性があり、非常に興味深い。本研究課題の研究目的であるマクロパイノサイトーシスの分子機構の解明に大きく寄与する結果である。以上のことから、実験計画に上げた3項目のうち1項目は遅れているが、1項目において非常に興味深い結果が得られており、達成度はおおむね順調に進展しているとした。
初年度の研究計画(3)である新規光活性制御タンパク質の確立が達成されていないので、引き続きRabGTPaseの光活性制御系の確立を目指す。具体的には、マクロパイノサイトーシスに深く関与するRab(Rab5, Rab10, Rab35)に絞り、光活性制御タンパク質とRabタンパク質の連結部分の構造を改変する。初年度の研究計画(1)で得られた研究成果であるRab10の一過的マクロパイノゾームへの局在について、さらに解析を進めていく。特にRab10陽性マクロパイノゾームは、これまでに知られていない新規の取り込み形態である可能性があり、一般的なRab5陽性マクロパイノサイトーシスとの比較により、Rab10陽性マクロパイノサイトーシスの特徴および役割を明らかにする。具体的には、Rab10陽性マクロパイノゾームから出芽するtube状の構造物に注目し解析を行う。現時点でRab10陽性のマクロパイノゾームに局在する分子としてRab10のエフェクター分子であるEHBP1を同定している。EHBP1は、膜のtube化を引き起こすEHD1およびsyndapin2と結合することが知られており、これらの分子の関与について解析を行う。さらに、Rab10陽性のマクロパイノゾームにおけるイノシトールリン脂質代謝についてもRab5陽性のものと比較する形で進めていく。また、Rac1の活性化から引き起こされるラッフル膜が、マクロパイノゾームとなりRab10およびRab5をリクルートするに至るまでの分子機構の詳細を明らかにするため、Rabの制御因子の寄与についても検討する。
おおむね計画通りに使用したが、年度末の学会発表にかかる費用がわずかに減額した。
物品費として使用する。具体的には、発現プラスミド構築のためのプライマーおよびDNA修飾酵素を購入する。
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Microscopy
巻: 63 ページ: 255–60
10.1093/jmicro/dfu003
PLOS ONE
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10.1371/journal.pone.0097749
http://www.kms.ac.jp/%7Eanatomy2/index.html
