| 研究課題/領域番号 |
26860150
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| 研究機関 | 日本医科大学 |
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研究代表者 |
石井 俊行 日本医科大学, 医学部, 助教 (10643140)
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| 研究期間 (年度) |
2014-04-01 – 2017-03-31
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| キーワード | コリン / P2X2 / コリン作動性アマクリン細胞 / 網膜 |
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| 研究実績の概要 |
下記2項目の検討を行った。
１、培養細胞を用いたP2X2型プリン受容体のコリン透過性の検討①
網膜コリン作動性アマクリン細胞で認められたコリン透過性が、P2X2型プリン受容体により生じたものかをさらに確認するため、ヒト胎児腎細胞由来の細胞株（HEK293）にP2X2型プリン受容体を強制発現させ、受容体のコリン透過性の有無について検討を加えた。強制発現にはリポフェクションを用い、P2X2型プリン受容体のcDNAをGFPレポーター遺伝子と共に遺伝子導入することで、GFP 陽性のHEK293 細胞にホールセルパッチクランプ法を適用し、P2X2型プリン受容体がコリン透過性を有することを確認した。なお、導入遺伝子の発現確認は、免疫組織化学的染色により確認した。
２、培養細胞を用いたP2X2型プリン受容体のコリン透過性の検討②
さらにP2X2型プリン受容体がコリンの透過性を有することを確認するため、高速液体クロマトグラフィー（HPLC）を用いてATP暴露時に細胞内にコリンが流入したことを上記で作成したHEK細胞を用いて確認した。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
2: おおむね順調に進展している
理由
研究計画に記した検討が概ね終了したため。
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| 今後の研究の推進方策 |
P2X2型プリン受容体を介したコリン取り込み及びアセチルコリン合成の検討を実施する。
P2X2型プリン受容体を介したコリンの細胞内取り込み機構が、生体内で機能しているかどうかを調べるため、放射性ラベルしたコリン（[3H]-choline）のコリン作動性アマクリン細胞内への3H 取り込み量を指標として検討する。3H 取り込み量の測定には液体シンチレーションカウンターを用い、[3H]-choline を含む溶液中で網膜をインキュベートし、ATPを加えたときの網膜組織中へのコリン（[3H]-choline）取り込み量を測定する。ATPをP2X型プリン受容体のアンタゴニストであるPPADSの存在下及び非存在下で加えることで、P2X2型プリン受容体を活性化した状態と活性化できない状態を再現し比較検討する。
次に、単離網膜細胞標本に[3H]-cholineを添加してインキュベートした後、GFPを発現しているコリン作動性アマクリン細胞のみをセルソーターを用いて他の細胞から分離する。コリン作動性アマクリン細胞内に取り込まれたアセチルコリンを、Sodium tetraphenylboron 及び3-heptanoneを用いて分離し、[3H]-acethylcholineの量を液体シンチレーションカウンターを用いて測定する。こうして取り込まれたコリンがアセチルコリンの合成に利用されているかどうか検討する。
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| 次年度使用額が生じた理由 |
使用予定の試薬を購入しなくとも研究を遂行できたため、次年度へ繰り越した。
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| 次年度使用額の使用計画 |
現在予定されている研究に用いる試薬の購入に追加で使用する予定である。
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