| 研究課題/領域番号 |
26860256
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| 研究機関 | 群馬大学 |
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研究代表者 |
瀬戸 絵理 群馬大学, 大学院医学系研究科, 助教 (40431382)
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| 研究期間 (年度) |
2014-04-01 – 2018-03-31
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| キーワード | 感染応答 / P-body / Trypanosoma cruzi |
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| 研究実績の概要 |
Processing body (P-body)は真核生物における細胞質mRNP（mRNA-蛋白質複合体）顆粒のひとつで、mRNAの分解や翻訳抑制を担う。P-bodyは定常状態の細胞にも存在しているが、ストレス刺激などの環境の変化でさらに形成が誘導される。そしてそこにはポリソームを離れたmRNAと翻訳不活化を担う蛋白質との複合体がリクルートされてくる。寄生虫感染の初期には、自然免疫応答として宿主のストレス応答関連蛋白質やサイトカインなどの翻訳調節が迅速かつ的確に行われていると考えられるが、その制御機構については不明な点が多い。これまでの研究で、偏性細胞内寄生原虫Trypanosoma cruzi (T.cruzi)のin vitro感染でP-bodyの形成が誘導されることを見出だした。また、感染によって形成誘導されるP-bodyが、T. cruzi の侵入およびamastigoteの増殖を抑制する働きをもつことを明らかにした。この効果は、抗寄生虫応答に関わる宿主遺伝子がP-bodyで翻訳調節を受けることによるものであると考え、感染時に形成されるP-bodyにルクルートされてくる宿主mRNAの同定とその機能解析を目的とした実験を進めている。現在までに、P-bodyの必須構成蛋白質であるLsm14Aをターゲットとした免疫沈降を行い、沈降前のcell lysate (input sample)と沈降後 (IPed sample)のそれぞれに含まれるmRNAからcDNAライブラリを作製した。非感染細胞と比較して感染細胞で2倍以上IPed sampleに濃縮されてくる遺伝子を次世代シーケンシングにより同定した。しかし、定量PCRによる比較では同定した遺伝子のLsm14Aへの結合量に非感染細胞と感染細胞で有意な差は見られなかった。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
3: やや遅れている
理由
平成28年度は感染細胞特異的にP-bodyに濃縮されてくるターゲット遺伝子を次世代シーケンシングにより同定し、ターゲット遺伝子のP-bodyとの共局在や、感染によるターゲット遺伝子の翻訳の経時的変化を調べていく予定であった。しかし、次世代シーケンシングでは非感染細胞と感染細胞でP-bodyへの取り込みに有意差が見られた候補遺伝子について、定量PCRでは有意差が認められず、ターゲット遺伝子の同定には未だ至っていないことから、研究は当初の計画より遅れていると考えられる。
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| 今後の研究の推進方策 |
これまでに行ったcDNAライブラリ調整法では、IPed sampleに多く含まれていることが予想されるpolyAがついていないRNAをロスしていた可能性が考えられる。そのため、rRNA除去法によるcDNAライブラリ調整を行い、再度シーケンシング解析を試みる。また、CRISPR/Cas9システムを用いてP-bodyノックダウン細胞株を樹立する。T. cruzi感染時における野生型細胞とP-bodyノックダウン細胞の遺伝子の発現変動を次世代シーケンシングやマイクロアレイによって比較解析する。
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| 次年度使用額が生じた理由 |
平成28年度はcDNAライブラリの調整方法を再検討する必要があったので、研究遂行に想定以上の時間を要し、未使用額が生じた。
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| 次年度使用額の使用計画 |
平成29年度の経費の主な用途は消耗品である。その内訳は細胞培養に必要な培地、血清、デイッシュなどのプラスチック製品、ガラス器具、抗体、オリゴ作製費、試薬類である。また国内学会で研究成果を発表するために必要な旅費も使用予定である。
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