| 研究課題/領域番号 |
26860297
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| 研究機関 | 北海道大学 |
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研究代表者 |
津田 祥美 北海道大学, 医学(系)研究科(研究院), 助教 (70447051)
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| 研究期間 (年度) |
2014-04-01 – 2017-03-31
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| キーワード | エボラウイルス / リバースジェネティクス / マクロファージ |
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| 研究実績の概要 |
エボラウイルスの主要標的細胞はマクロファージや樹状細胞であるといわれているが、これらの細胞がエボラウイルス感染の致死的病態にどのような役割をはたしているかは未だ不明である。本課題では、まず細胞内で発現するmicroRNA（miRNA）の性質を利用し、マクロファージや樹状細胞で増殖できない組換えウイルスの作出を試みた。エボラウイルスおよび遺伝子全長を扱う実験については日本国内では許可されていないため米国の施設において実施した。エボラウイルスのL遺伝子の後にmiRNAターゲット配列もしくは対照配列を組込んだ全長遺伝子を作出し、BSL4施設において組換えウイルスの作出を試みた。今後の実験に用いるためにヒトに病原性を持つ野生株およびマウス馴化株について作出を試みた結果、両株ともに組換えウイルスを作出できた。またmiRNAターゲット配列の4回繰り返し配列として組込んだが、途中欠損することなくウイルス遺伝子に組込まれることが確認できた。一方でマウス馴化株のウイルス力価が想定より低値であったため作出細胞を変更したところ、力価測定に用いたVero細胞では親株と同程度の増殖能力をもつ組換えウイルスを作出できた。そこで作出した野生株由来の組換えウイルスを用いてヒトマクロファージ系細胞株であるU937細胞およびヒト肝癌由来であるHuh7細胞でのウイルス増殖を比較した。その結果、マクロファージで多く発現していると推定されるmiRNAターゲット配列を組込んだ組換えウイルスは対照配列を組込んだウイルスと比較してU937細胞で特異的にウイルス増殖が抑制される傾向にあることが確認された。一方で組換えウイルスは遺伝子変異のない親株よりも若干であるが増殖能力が低い傾向が観察され、動物実験への影響に留意する必要があることが示唆さるなど、今後予定している動物実験に向けて有用な知見を得ることができた。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
2: おおむね順調に進展している
理由
平成26年度は計画したmiRNAターゲット配列を組込んだ全長遺伝子プラスミドを作出し、作出したプラスミドから組換えウイルスを合成することに成功した。さらに培養細胞を用いたウイルス増殖実験により、マクロファージで多く発現していると推定されるmiRNAの相補配列をmRNAに組込んだ組換えウイルスは対照配列を組込んだ対照株と比較してマクロファージ由来細胞株で特異的にウイルス増殖が抑制される傾向があることが確認された。本研究は翌年度に予定している実験動物を用いた解析へつながる重要な結果であり、本年度の目標を達成できたと考えられる。一方で、組換えウイルスの作出に時間がかかったため、米国滞在中にもう１つの目的であったマウス馴化株の致死的病原性を規定しているNP およびVP24遺伝子の変異を組込んだ組換えウイルスの性状解析については十分に遂行できなかったことから、本年度の達成度は概ね順調に進展していると評価した。
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| 今後の研究の推進方策 |
平成27年度は、H26年度に作出した組換えウイルスについて、種々の培養細胞を用いてより詳細なウイルス増殖の変化を確認するとともに、ウイルス増殖だけでなく、免疫応答などの宿主反応について解析していく予定である。さらにマウス馴化株由来の組換えウイルスをマウスに実験感染し、病原性の変化、更にその変化をもたらしているウイルス増殖や宿主応答を解析することで、マクロファージでのウイルス増殖が病態にどのように関与しているか解明していく計画を立てている。実際には主要標的細胞であるマクロファージや樹状細胞で増殖できないことで、ウイルス増殖が相対的に抑制される、もしくは感染後期にウイルス抗原が確認されていた実質細胞などで早期からウイルス増殖が観察される可能性が考えられる。そこで血液、腹腔内マクロファージ、肝臓及び腎臓などのエボラウイルスの標的組織を経時的に採材し、病理学的、ウイルス学的解析によりウイルスの組織指向性とウイルス増殖を解析する。さらにマクロファージや樹状細胞でのウイルス増殖がこれまでに報告されている宿主応答誘発に必要かを解明するため、サイトカインやインターフェロンの産生、血液凝固因子の増減などの宿主応答を比較解析する予定である。一方で米国滞在期間は限られるため、ウイルスを用いた解析だけでなく個々のウイルスタンパク質発現系を用いた解析を日本国内で実施していく予定である。
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| 次年度使用額が生じた理由 |
H26年度はエボラウイルス遺伝子組換えが予定より順調に進んだこと、一方でmiRNAの選定に用いる予定であったリポーターアッセイ系の作出に時間がかかり解析まで終了しなかった。そのため購入を予定していた試薬を変更することとなり次年度使用分として差額が生じた。
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| 次年度使用額の使用計画 |
当該助成金は、継続して行っている研究遂行に必要な試薬購入のためH27年度初めに使用予定である。翌年度分として請求した助成金は今後の予定で示した課題を遂行するための米国への渡航費および試薬等物品購入費用として使用する予定である。
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