研究課題/領域番号 |
26860372
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研究機関 | 熊本大学 |
研究代表者 |
田崎 雅義 熊本大学, 大学院生命科学研究部, 助教 (50613402)
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研究期間 (年度) |
2014-04-01 – 2017-03-31
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キーワード | アミロイドーシス / 組織診断 / プロテオミクス / 質量分析装置 |
研究実績の概要 |
アミロイドーシスは、可溶性の蛋白質が難溶性のアミロイド線維へと変化し、諸臓器に沈着することで重度の臓器障害を引き起こす難治性の疾患群である。本疾患群は、アミロイドを形成する蛋白質によって各疾患に分類され、疾患ごとに治療法が異なるため、正確に診断することが極めて重要である。 本研究は、アミロイドに特異性の高い新たな蛋白質抽出法を開発し、質量分析装置を用いて、病理組織切片から正確にアミロイドの病型を診断する手法を構築することを目的とする。計画初年度である平成26年度は、アミロイドに特異性の高い蛋白質抽出法を開発するために、各種界面活性剤(SDS, Zwittergennt, CHAPS)や変性剤(尿素やGnHCl)、酵素(プロテイナーゼK)を用いて検討を行った。その結果、従来法と比較して、プロテイナーゼKを蛋白質を抽出する過程で使用することで、検出される蛋白質に占めるアミロイド原因蛋白質の割合が増加した。本法は、AL, AA,FAP,SSA など様々なアミロイドーシスの病理診断にも有効であることが明らかとなった。さらに、検討を進める中で、原因不明の角膜アミロイドーシスにおいて、質量分析装置を用いた解析法を利用することで、アミロイド原因蛋白質の同定に至り、英文として報告した (Tasaki et al., Amyloid, 2015)。 また、ALアミロイドーシスの予後予測マーカーの探索および病態解析を行うために、本年度は、質量分析装置を用いて、ALアミロイドーシスのアミロイド沈着組織を解析した。その結果、ALアミロイドの患者組織には、様々なタイプの免疫グロブリン軽鎖由来の蛋白質が沈着することが明らかとなった。
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現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
2: おおむね順調に進展している
理由
アミロイドーシスにおける特異性の高い組織診断法の開発に関して、初年度は、各種蛋白質抽出法を検討した結果、プロテイナーゼKをアミロイド蛋白質の抽出過程で用いることで、質量分析装置で検出される蛋白質に占めるアミロイド原因蛋白質の割合が増加することが明らかとなった。本解析法は、各種アミロイドーシス (AL, FAP, AA, SSA) の原因蛋白質同定にも有用であることがわかった。また、プロテイナーゼKを処理することで、アルブミンやアポリポ蛋白質Eなどアミロイド沈着部位に存在する非特異的な蛋白質の検出ペプチド数が減少することがわかった。さらに質量分析装置を用いた解析を進める中で、原因不明の角膜アミロイドーシスの原因蛋白質を同定でき、その診断に有用であったことを海外英文誌に報告した。 ALアミロイドーシスにおける予後予測マーカーの開発および病態解析に関して、ALアミロイドーシス患者組織を質量分析装置で解析した結果、組織に沈着する各種軽鎖由来の蛋白質を同定できた。 以上に示すように、特異性の高いアミロイド診断法およびALアミロイドーシスの予後予測マーカーを確立するための準備が整ってきたため、順調と考えられる。
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今後の研究の推進方策 |
次年度は、前年度の研究を継続して行うと同時に、更に研究を発展させる。前年度に確立した新規アミロイド抽出法を用い、代表的な全身性アミロイドーシス(FAP、老人性アミロイドーシス 、ALアミロイドーシス、AAアミロイドーシス、透析アミロイドーシス)の剖検サンプルを20 検体ずつ解析し、アミロイド原因蛋白質の検出率および、非アミロイド原因蛋白質の除去率を従来法と多数例で比較検討する。また、本抽出法がアミロイドの抽出に作用するメカニズムについても解析を行う。さらに、本解析において、最低限必要なアミロイド沈着量について検証するとともに、原因不明アミロイドの同定も試みる。 ALアミロイドーシスにおける予後予測マーカーの開発および病態解析に関して、前年度に同定した蛋白質に加え、さらにALアミロイドーシス患者の組織沈着アミロイドを解析することで蛋白質を同定する。その結果と臨床症状と照らし合わせ、L 由来ペプチドの予後予測マーカーとしての有用性を評価するとともに病態を解析する。
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次年度使用額が生じた理由 |
組織から蛋白質を抽出し、質量分析装置で測定する際の前処理に必要な遠心濃縮装置を計上していたが、学内施設に新しく購入された遠心濃縮装置を使用することが可能となったため。
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次年度使用額の使用計画 |
平成27年度は、前年度に検討したアミロイド抽出法の有用性を検証するとともに、ALアミロイドーシスの病態を解析するために、組織から蛋白質を抽出し、質量分析装置で解析するための関連試薬および消耗品を購入する。また、アミロイド原因蛋白質を検証するために、抗体を購入する。これらの研究成果を発表するために、国内旅費に使用する。当初の計画通り、以上に示した研究に次年度の研究費を用いる。
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