研究課題
本研究は脂肪酸代謝異常症がもたらすミトコンドリアの品質低下の機序を明らかにし治療法の開発に寄与することを目的とする。ミトコンドリアでの脂肪酸代謝系は飢餓時の主要なエネルギー生産システムである。これまでの申請者らの研究などにより、ミトコンドリア呼吸鎖や脂質代謝系の遺伝子異常をもつ線維芽細胞では増殖期にミトコンドリアDNAが大幅に減少することを蛍光顕微鏡観察により見出している。異常遺伝子の機能からは代謝異常は予測されるが、ミトコンドリアDNA量の減少は予見し得ないことから、代謝異常が引き起こす細胞内/ミトコンドリア内環境の変化がミトコンドリアDNA量の維持の妨げとなり、間接的にミトコンドリア電子伝達系に影響を与えると考えられる。この新たな現象を生化学的手法、光学・電子顕微鏡を駆使して詳細に解析し、脂肪酸代謝異常症の症状の緩和につながる薬剤の探索を進展させたいと考え、研究を進めている。具体的には、まず代謝異常の表現型がみられる栄養制限下でのミトコンドリアDNA量の減少やミトコンドリアの断片化、融合頻度、短径、長径といった形状変化や細胞内分布の観察をDNAあるいはミトコンドリア特異的蛍光色素と蛍光顕微鏡を用いて行っている。さらに、連続表面走査型電子顕微鏡を用いたミトコンドリア内膜（クリステ）の三次元観察を行い、nmオーダーの解像度でクリステの形態を観察しつつある。そのための最適な標本作製方法や三次元立体構築を効率化させるための染色方法については、概ね検討を終えることができた。今後、遺伝子異常をもつ実際の標本を用いた形態観察を行おうとしている。
2: おおむね順調に進展している
本研究では、FAODによりエネルギー需要に依存してmtDNA量、ミトコンドリア内タンパク質量が低下することに着目し、その機序を分子・細胞レベルにおいて解明する。さらにミトコンドリアの質的異常を可視化する系を確立を目的としている。具体的には定常期とエネルギー需要の高い増殖期の比較を軸に初年度には主に以下を明らかにするとしていた。a) mtDNA減少の詳細な時期と機序b) mtDNA量の減少がミトコンドリアの形態に与える影響蛍光顕微鏡を用いた線維芽細胞のミトコンドリアDNA量の減少やミトコンドリアの断片化、融合頻度、短径、長径といった形状変化や細胞内分布の観察に関しては、系を立ち上げることができている。脂肪酸代謝異常症においては栄養が制限される培地での観察で表現型が顕著であった。ミトコンドリアの形態に関しては、蛍光顕微鏡での外形の観察に加え、連続表面走査型電子顕微鏡を用い通常はひだ状の形態をとる内膜の微細構造観察を行うが、そのための標本作成条件も検討を終えた。遺伝子異常による脂肪酸代謝能や呼吸鎖複合体の活性については測定系を検討しており、多少の遅れはあるものの概ね順調に進展しているといえる。
26年度の計画で、現在は測定系の立ち上げにとどまっている脂肪酸代謝能や呼吸鎖複合体の活性についての解析を27年度には遂行する。連続表面走査型電子顕微鏡による観察については、まだ新しい手法であり組織化学染色を併用した標本作製法の開発を行ったので方法論として論文にまとめることとする。形態異常を引き起こしたミトコンドリアの細胞内での寿命の解析が27年度の主な研究課題となる。
慎重に測定系を立ち上げたため、当初予定額のすべてを使用することはなかった。また、平成26年度の受領額を超えないように注意したために、次年度使用額が0より大きくなった。
平成26年度に力をいれた蛍光顕微鏡や連続走査型電子顕微鏡を用いた観察においては共用機器であり本年度は使用料がかからなかったため、標本作成費用のみで研究を行うことができ、当初予定額より少なくなった。平成27年度には名古屋大学に新たに導入された連続走査型電子顕微鏡も使用する予定であり、そちらは機器使用料が課されるため繰越額からまかなう予定である。その他は、ほぼ予定通り使用する予定である。
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