研究課題/領域番号 |
26860909
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研究機関 | 島根県産業技術センター |
研究代表者 |
牧野 正知 島根県産業技術センター, その他部局等, 主任研究員 (30529582)
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研究期間 (年度) |
2014-04-01 – 2016-03-31
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キーワード | 皮膚 / 老化 / バイオマーカー |
研究実績の概要 |
皮膚は外界に露出しているという特徴から紫外線の暴露を避けられず、その結果として生じた表現系変化を光老化という。本研究では光老化の指標と成り得るバイオマーカー蛋白質の探索と、その検出方法の開発を目的としている。今年度は主に皮膚の培養細胞を人工的に老化させたモデルの調製方法の検討、また細胞から抽出した蛋白質の網羅的な検出方法について検討した。まず細胞の老化は、継代を重ねる、過酸化水素を添加する、あるいは紫外線を照射する等の処理によって行った。老化度を評価する方法には既存のSA beta-Gal染色法等が利用可能であるが、紫外線暴露によって核内に発生する損傷DNA量をELISA法で定量出来る評価系も構築した。一方、蛋白質の網羅的な検出方法にはショットガンプロテオミクスの手法を採用し、これによるプロテオーム解析にも着手した。予備的な実験から細胞骨格を形成する高発現蛋白質等による同定効率の低下が問題になることが分かったため、この影響を低減させるため陽イオン交換カラム等による試料前処理条件について検討を進めた。
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現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
3: やや遅れている
理由
ショットガンプロテオミクスの手法によって同定できている蛋白質数は満足のいくものではなく、高発現蛋白質を除去する方法の検討に時間を費やしている。また光老化モデル作成のために紫外線を培養細胞に照射しているが、一度に大量の紫外線を暴露させてしまうと細胞死が起こるため、細胞に暴露する紫外線の波長と輝度、照射時間間隔、実験系として最適な最大総暴露量等の条件設定に予想以上に時間がかかっており、当初の計画より遅れている。
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今後の研究の推進方策 |
まず紫外線による人工的な光老化方法を老化関連遺伝子の発現解析等も組み合わせて評価し最適化する。また生理老化モデル細胞と光老化モデル細胞における紫外線損傷DNAの除去修復速度の比較も行い、光老化度との関連性について検証する。平行してショットガンプロテオミクスによる同定効率の向上のため、分取精製用HPLCによる分画精製を試みる。必要となる蛋白質精製用カラム等は準備済である。網羅的発現解析が困難な場合はターゲットを絞ったうえでLC-MSMSによる定量分析を行う。計画では光老化モデル細胞のバイオマーカー探索から得られる知見を表皮あるいは表皮角質層へ拡張し検証することとしているが、予想より研究スケジュールが遅れていることを考慮し、光老化モデル細胞での探索・評価検証を重点的に行う。
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次年度使用額が生じた理由 |
計画より研究が遅れていることにより、使用予定の一部の消耗品試薬類の購入を次年度に先送りしたため。
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次年度使用額の使用計画 |
遺伝子発現解析用の試薬や培養細胞の購入に充てる。
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