2014 年度実施状況報告書

膀胱癌微小環境中のCXCL1発現と尿中Exosome内CXCL1検出の臨床応用

研究課題

研究課題/領域番号	26861290
研究機関	奈良県立医科大学
研究代表者	三宅牧人奈良県立医科大学, 医学部, 助教 (80601400)
研究期間 (年度)	2014-04-01 – 2016-03-31
キーワード	癌進展機構 / マクロファージ / 線維芽細胞
研究実績の概要	膀胱癌微小環境中の腫瘍関連性マクロファージ (Tumor associated macrophage, TAM) および腫瘍関連性繊維芽細胞 (Cancer associated fibroblast, CAF) と癌細胞間におけるケモカイン CXCL1 の役割を明らかにすべく検討を行ってきた。ヒト膀胱癌パラフィン包埋切片を対象として CXCL1, CD204 (TAM marker), aSMA (CAF marker), MMP2, E-cadherin 抗体を用いた免疫染色を実施，評価した。CXCL1 高発現症例において，病期進展率が高く，MMP2 高発現，E-Cadherin 消失と関連しており，さらに腫瘍組織内 TAM および腫瘍周囲間質組織中に CAF が多く存在していることが分かった。二重蛍光免疫組織染色により，腫瘍組織近傍の TAM, CAF はいずれも CXCL1 を発現していた。これらのことより，CXCL1 は，膀胱癌と周囲の TAM, CAF 間の介在シグナルとして機能していることが示唆された。そしてそのシグナルにより，癌細胞の上皮間葉移行を促進し，間質への浸潤，多臓器への転移へと進展していくと考えられる。膀胱癌培養細胞内の CXCL1 の発現を定量したところ，T24 細胞において高発現していた。T24 細胞内の CXCL1 をノックダウンすることで，どの細胞内シグナル伝達経路が抑制されるか，また最終産物としてどのような癌関連蛋白が影響をうけるかをシグナルアレイおよびタンパクアレイで検討した。その結果，癌細胞内の CXCL1 は MAPK/ERK カスケードを介して，Interleikin-6 (IL6) の発現亢進と Metalloproteinase inhibitor 4　（TIMP4）の発現抑制と関連していることが分かった。
現在までの達成度 (区分)	現在までの達成度 (区分) 2: おおむね順調に進展している理由 160症例のヒト膀胱癌組織を用いた免疫組織染色を実施し，それぞれのマーカー間の相関，術後予後との関連を明らかにできた。また，CXCL1 の下流シグナルについての解析も順調に進めている。今後は，マクロファージと線維芽細胞の培養細胞を用いた CXCL1 発現細胞株を作成し，癌細胞との相互関係を明らかにしていく計画を立てている。
今後の研究の推進方策	マクロファージと線維芽細胞の培養細胞を用いた CXCL1 発現細胞株 (レンチウィルスベクター) を作成し，癌細胞との相互関係を明らかにしていく。以下2つのヌードマウスモデルを使用する予定である。膀胱における腫瘍間質細胞での CXCL1 の役割を検討するため，ヌードマウスの皮下にマクロファージ・繊維芽細胞と癌細胞を同時注入し，腫瘍の増殖とその周囲の間質細胞を解析する。ヌードマウスの尾静脈から膀胱癌細胞を注入して作成する肺転移モデルを使用する。抗 CXCL1 中和抗体による治療効果を判定することで，CXCL1 の転移への影響を明らかとする。
次年度使用額が生じた理由	免疫染色により CXCL1の受容体である CXCR1 および CXCR2 についても併せて検討する予定であったが，実施できていない。
次年度使用額の使用計画	次年度に上記を予定している。