| 研究課題/領域番号 |
26861372
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| 研究機関 | 京都大学 |
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研究代表者 |
谷口 美玲 京都大学, 医学(系)研究科(研究院), 客員研究員 (80706713)
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| 研究期間 (年度) |
2014-04-01 – 2018-03-31
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| キーワード | 内耳再生 / 内耳幹細胞 / 遺伝子解析 |
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| 研究実績の概要 |
本研究の目的は、内耳幹細胞を含むと考えられるtympanic border cellの遺伝子発現解析を行い、性質と機能を解明することである。具体的には、Laser Captured Microdissection法によって内耳の凍結切片からtympanic border cell、内耳感覚上皮などを採取し得られたサンプルからRNAを調整しcDNAマイクロアレイを用いて解析を行う。
本年はLaser Captured Microdissection（以下LCM）を内耳の切片標本に行い、RNAを採取する方法について検討した。胎生18日、哺乳1日、哺乳4日のマウスの内耳を採取して凍結切片を作成し、特定の細胞集団（tympanic border cells, greater epithelial ridge, supporting cells）をLCM技術を用いて回収した。まず、様々な条件のもとでLCMに適したサンプルの固定および染色に対する条件検討を行った。結果は、内耳の凍結切片に対してはメタノール固定およびクレシルバイオレット染色が形態保持および染色性の面で適していることが分かった。LCMを用いる切片の厚さやレーザーの強さについても条件検討を行った。LCMを用いて採取したサンプルからのRNAの調整には、微量RNA回収用のキットを用いた。RT-PCRにて、RNAが採取できていることを確認した。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
3: やや遅れている
理由
cDNAマイクロアレイに必要なRNAの質についての解析が不十分である。
さらにどのくらいの切片を用いれば、cDNAマイクロアレイを行うことができる量のRNAを採取できるかの検討をする必要がある。
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| 今後の研究の推進方策 |
マウス内耳の凍結切片からLCMの技術を用いて採取したRNAについて、cDNAマイクロアレイの解析に適した質および量を採取できているか、検証する。内耳幹細胞を含むtympanic border cellに特異的に発現する遺伝子を発見するため、cDNAマイクロアレイを行い、その結果の解析を行う。
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| 次年度使用額が生じた理由 |
平成26年度研究経費では、マイクロアレイの実験データの蓄積・解析に用いるコンピュータを計上していたが、内耳のサンプリングや固定などの条件検討に十分な時間をかけたため、研究に遅延が生じ、マイクロアレイの準備については次年度に行うこととした。また、国内学会にて本研究成果についても次年度に行う予定とした。
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| 次年度使用額の使用計画 |
平成27年度からマイクロアレイの解析を開始する。消耗品費については、動物の経費に加え、マイクロアレイに必要な試薬などを計上している。平成27年度以降は前年度の結果を含めた成果の公表の増加を考え、国際学会、国内学会、論文投稿などに関連する諸費用を旅費、謝金、その他に計上している。前年度の未使用額はこれらの経費に充てることとする。
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