| 研究課題/領域番号 |
26861671
|
|---|
| 研究機関 | 東京医科歯科大学 |
|---|
研究代表者 |
大山 厳雄 東京医科歯科大学, 大学院医歯学総合研究科, 非常勤講師 (30451975)
|
|---|
| 研究期間 (年度) |
2014-04-01 – 2018-03-31
|
| キーワード | 骨造成 / 細胞外タンパク質 / システインリッチドメイン |
|---|
| 研究実績の概要 |
顎口腔領域の顎骨疾患に対し、骨造成は患者のQOL向上のために非常に重要であり、現在患者自身の侵襲を伴う自家骨移植の他に有効な方法は確立していない。また近年、骨形成促進タンパク質であるBMPの臨床応用の報告は散見されるが、その使用の有益性は確証されていない。前回、我々は骨形成タンパク質であるBMPに関連した骨形成促進因子（VWC2, VWC2-like)を発見したため、本研究ではそのメカニズムを解明し、少しでも早い臨床応用を目的とする。
1.VWC2の骨芽細胞分化促進に対する作用の解析：細胞外タンパク質であるVWC2を培地内に混入し、マウス頭蓋骨骨芽細胞前駆細胞の細胞株であるMC3T3-E1細胞またはマウス頭蓋骨から得たPrimary osteoblastを培養。骨の石灰化に深く関与する酵素であるALP活性解析、Alizarin Red染色による基質石灰化能試験、real-time PCRによる骨芽細胞分化マーカー遺伝子の発現解析を行う。以上により骨芽細胞に分化誘導をかけただけの群と比較して、VWC2添加群がより骨芽細胞分化を促進することを確認する。
2.VWC2-likeの骨芽細胞分化促進に対する作用の解析：VWC2-likeを培地に混入し、上記1.と同様の実験を行い、骨芽細胞分化に対するVWC2-likeの作用を解析する。
3.in vivoにおけるVWC2、VWC2-likeの骨形成能の解析：5週齢のマウス頭部に切開を加え、頭蓋骨に軟組織生検用のバイオプシーパンチで骨欠損モデルを作成する。そこに、コラーゲンスポンジにBMP-2, VWC2, VWC2-likeを様々な濃度で含ませたものを載せ、縫合する。μCTにて経時的な骨形成の変化を観察し、一定の間隔ごとに骨に沈着する蛍光物質を投与する。切片を作成し、組織学的な解析および、骨の形成スピードを測定、コントロール群と比較する。
|
| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
2: おおむね順調に進展している
理由
1.VWC2の骨芽細胞分化促進に対する作用の解析：ALP活性能試験および石灰化能試験、骨芽細胞分化マーカー遺伝子発現解析においてVWC2添加群とコントロール群間での有意差を得ることができた。
2.VWC2-likeの骨芽細胞分化促進に対する作用の解析：VWC2-like単独での骨形成促進作用が認められず、除外した。今後、さらなる検討が必要である。
3.in vivoにおけるVWC2、VWC2-likeの骨形成能の解析：VWC2添加群で有意な骨形成促進作用が得られた。
VWC2添加群での骨形成促進作用についてデータをまとめ、論文作成し、現在英字雑誌に投稿中である。
|
| 今後の研究の推進方策 |
今後は、VWC2遺伝子のノックアウトマウスまたは過剰発現マウス遺伝子を作成し、実際にVWC2が生体の形成、代謝にどのように関与しているか解析を行う。さらに、実際の患者検体を用いて発現解析を行い、VWC2の過剰な発現および発現不全によりどのような病態が現れるかの解析を行なっていく。詳細なメカニズムの解明を行い、臨床応用にさらに近づけるようなエビデンスを確立する。
VWC2-likeに関してはin vitroにおいて未だ明らかな石灰化促進作用を認めないが、今後in vitroおよびin vivoにおいてさらなる検証を行なっていきたい。
|
| 次年度使用額が生じた理由 |
研究計画は順調に進んでいたが、論文投稿と、そのリバイスが遅延し、さらにそのリバイスのための追加実験を必要としたため、次年度使用額が生じた。
|
| 次年度使用額の使用計画 |
１．BMPによるMC3T3細胞の骨代謝マーカーの変化をRTPCRで解析する。
２．骨欠損マウスを用いて、VWC2の骨造成能を解析する実験で骨の切片の免疫染色行う。
３．論文投稿と、新たに学会発表を行う。
|
