| 研究課題/領域番号 |
26861790
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| 研究機関 | 徳島大学 |
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研究代表者 |
赤澤 友基 徳島大学, 大学病院, 医員 (10646152)
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| 研究期間 (年度) |
2014-04-01 – 2017-03-31
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| キーワード | 乳歯 / 歯髄細胞 |
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| 研究実績の概要 |
＜目的＞歯髄はう蝕や外傷などの様々な外的刺激に対し、修復象牙質を形成する自己修復能を有する。近年、この過程に歯髄に含まれる乳歯歯髄幹細胞と共に、間葉系幹細胞が関与していることが知られるようになってきた。ケモカインstromal cell derived factor 1α(SDF-1)は、Gタンパク質共役受容体であるCXCR4を介して間葉系幹細胞や血管内皮前駆細胞に対する遊走誘導に関与していることが知られている。本研究では、歯髄における間葉系幹細胞の遊走にSDF-1/CXCR4シグナルが関与しているのかを明らかにすることを目的とした。
＜材料と方法＞ヒト乳歯歯髄細胞として、我々の樹立したSDP11を使用した。またヒト間葉系幹細胞株UE7T-13を使用した。それぞれの細胞について、播種2日後にmRNA、 cell lysate (CL)、 conditioned medium (CM)を回収しRT-PCR法、 Western blotting法、 migration assayに使用した。また同条件下で、免疫染色も行った。
＜結果および考察＞1.SDF-1およびCXCR4 mRNAの発現の確認：RT-PCR法により、SDF-1αおよびCXCR4 mRNAの発現が全ての細胞種で認められた。2. SDF-1およびCXCR4産生の確認：Western blotting法および免疫染色法により、SDP11及びUE7T-13にタンパクレベルでのSDF-1とCXCR4の発現が認められた。3.SDP11により産生されたSDF-1の細胞遊走能の検討：Migration assayより、SDP11のCMはUE7T-13の細胞遊走を誘導した。CXCR4の阻害剤であるAMD3100で処理されたUE7T-13はSDP11由来のCMによる細胞遊走を抑制された。以上のことから、SDP11の産生するSDF-1は間葉系幹細胞を誘導することが示唆された。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
2: おおむね順調に進展している
理由
今回実験を始めるに当たり、不死化ヒト乳歯歯髄細胞株を樹立した。外来で治療のために抜歯された乳歯より分離した歯髄細胞から不死化細胞株の樹立を行った。3つの細胞株を作製し、そのうち骨芽細胞や脂肪細胞への分化誘導能がある細胞株をヒト乳歯歯髄細胞SDP11として、以後の実験に使用した。
歯髄細胞の恒常性を解析するにあたり、間葉系幹細胞の遊走誘導能が知られているSDF-1の発現調べた。SDP11におけるSDF-1の産生をmRNAレベルおよびタンパク質レベルで示すことができた。また、SDP11のcondition mediumが間葉系幹細胞UE13T-7細胞の遊走を誘導することをtransmembrane migration assayにより示した。さらにSDF-1の受容体であるCXCR4の阻害剤AMD3100を使用することにより、遊走誘導が阻害されたことから、この細胞遊走誘導はSDP11によって産生されたSDF-1が関与していることが示唆された
以上の解析結果から、不死化ヒト乳歯歯髄細胞株の樹立を行い、歯髄細胞の恒常性維持にSDF-1が関与している可能性が示唆されたことから、「おおむね順調に進展している」と考えている。
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| 今後の研究の推進方策 |
H26年度の結果から、歯髄細胞が産生するSDF-1によって、間葉系幹細胞が遊走誘導されることが示唆された。遊走誘導された間葉系幹細胞は歯髄内の様々な細胞と接触し、細胞間ネットワークを介して、歯髄の再生および恒常性の維持に寄与していると考えられる。
そこで、間葉系幹細胞と歯髄細胞間の細胞間ネットワークを解析するにあたり、それぞれの細胞を識別するために、間葉系幹細胞にマーカーとしてGreen Fluorescent Protein（GFP）の発現ベクターをtransfectionする。これにより、共存培養下でも間葉系幹細胞と歯髄細胞の識別や解析は容易になる。歯髄細胞と間葉系幹細胞を共存培養させることにより、それぞれの細胞における分化状態や機能調節機構の変化が生じると考えられる。その変化を解析することにより、細胞間ネットワークを考察することができると考えている。
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| 次年度使用額が生じた理由 |
年度末に購入を予定していた試薬が残金をオーバーしていたため、購入できず残ってしまった。
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| 次年度使用額の使用計画 |
次年度の研究費が使用可能になるまでの間に必要な消耗品を購入する。
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