| 研究課題/領域番号 |
26870222
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| 研究機関 | 金沢大学 |
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研究代表者 |
丹下 正一朗 金沢大学, 医学系, 博士研究員 (40571211)
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| 研究期間 (年度) |
2014-04-01 – 2017-03-31
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| キーワード | DNA脱メチル化 |
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| 研究実績の概要 |
細胞のがん化とDNAのメチル化との関連については膨大な研究の蓄積がある一方で、がん化とDNA脱メチル化の制御についての研究は未だ十分ではない。申請者のグループでは、DNA脱メチル化の第一段階に関わるTET1酵素の発現が、CpGアイランドメチル化表現型(CIMP)陽性の大腸がん細胞株では極端に低いこと、及び、肺がん細胞株に対し上皮間葉転換(EMT)を誘導させる際に発現が上昇することを見出した。本研究は、CIMP表現形の誘導、成立やがん細胞におけるEMTの進行という諸過程にTET1酵素が果たす役割を解明することを目的としている。
本年度は、前年度に引き続き、公共のデータベースThe Cancer Genome Atlas(TCGA)を用いた情報学的解析から得た炎症性サイトカインによるTET1遺伝子発現の制御機構を解析し、報告を纏める段階である。また新たに、TCGAに登録されている乳がん検体を用いた解析から、難治性のBasal-like乳がんにおいて、比較的予後良好なLuminal乳がんに比較してTET1mRNAの発現が有意に高いことを発見した。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
2: おおむね順調に進展している
理由
申請者の所属が変更になり、新たな所属における研究環境の整備と実験系の構築に時間を要した。このため、平成27年度に予定していたTET1酵素の標的遺伝子の探索は平成28年度に持ち越すこととなった。
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| 今後の研究の推進方策 |
前年度までに作成した研究論文の内容を再検討し、投稿を行う。
また現在、下記2種類の培養細胞系を軸として、主として次世代シークエンサーを用いてTET1酵素が標的とする遺伝子の特定を予定している。
・TET1低発現のがん細胞株において恒常的にTET1酵素を高発現するクローン
・TET1高発現のがん細胞株におけるCrispr/Cas9システムによるTET1遺伝子ノックアウト細胞
これらの解析においてトランスクリプトーム解析を行い、発現が変化する遺伝子をTET1標的遺伝子候補とする。また、TET1蛋白質が結合するゲノム上の領域をChIP-Seq法によって解析する。ゲノムDNAの脱メチル化の過程で生じる5-ヒドロキシメチルシトシン(5hmC)特異的抗体を用いたメチル化DNA沈降法(MeDIP)による解析MeDIP-Seq法により、TET1酵素が基質とするゲノム上の領域を解析する。トランスクリプトーム解析によってTET1の強制発現時に発現が上昇し、かつそのプロモーター領域におけるTET1の集積、5hmCレベルの増加が見られる遺伝子をTET1酵素の標的遺伝子とする。順調に研究が進行した場合、TET1標的遺伝子が細胞の増殖能、運動能、造腫瘍能等にどのように貢献するのかを評価する実験の構築を予定している。
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| 次年度使用額が生じた理由 |
申請者は、TET1酵素が標的とする遺伝子の解析について、より精緻な情報を取得するために次世代シークエンサーによるRNA-SeqおよびChIP-Seqによる解析を行うことにした。これに伴い、解析を行うために必要な試薬の納入に時間を要したほか、金沢大学の保有する次世代シークエンサーの利用状況から解析までの待ち時間が発生しており、シークエンサーによる配列決定ならびにデータ解析は次年度に行われることになったため。
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| 次年度使用額の使用計画 |
次世代シークエンサー(Illumina社製HiSeqおよびMiSeq)用のライブラリ試薬の購入、および次世代シークエンサー解析に必要な諸経費としての使用を予定している。
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