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2014 年度 実施状況報告書

高分解顕微鏡観察を主としたカリウムチャネルKcsAの柔軟な構造と機能の相関解明

研究課題

研究課題/領域番号 26870233
研究機関福井大学

研究代表者

角野 歩  福井大学, 医学部, 特別研究員 (80717140)

研究期間 (年度) 2014-04-01 – 2016-03-31
キーワードカリウムチャネル / KcsA / 原子間力顕微鏡 / 電子線トモグラフィー / 構造変化
研究実績の概要

pH依存性カリウムチャネルであるKcsAは、酸性条件下でイオンの通り道を開く。KcsAの構造は、大きく分けて膜貫通ドメインと細胞質ドメインに分けられる。開閉各状態における膜貫通領域の構造は結晶構造により明らかになっているが、細胞質ドメインの構造は未だ不明である。本研究では、水中・非結晶化状態におけるKcsAチャネルの細胞質ドメインの構造、および細胞質ドメインの構造変化がチャネル機能に及ぼす影響について明らかにすることを目的とする。
平成26年度は、細胞質ドメインが水中で特定の硬い構造をとっているのか、それとも柔軟に揺らいでいるのかを原子間力顕微鏡(AFM)観察により検討した。脂質膜に再構成したKcsAチャネルを雲母基板上に組織化し、開閉各状態をとるpH条件下でAFM観察した。膜表面から数nm突出した細胞質ドメインらしき構造が観察されたが、得られた構造は不鮮明な粒状であり、一分子毎の鮮明な構造は観察されなかった。ここで用いた一般的なAFM観察では、一枚の画像の取得に10分程度要しており、構造揺らぎに対して走査速度が遅すぎて構造が平均化されたために、不鮮明な粒状の構造として観察されたのだと考えられた。さらに構造が揺らいでいるのかどうか確認するため、10 frame/secの走査速度で高速AFM観察を行った。すると、高速に揺らぐ細胞質ドメインと思われる構造が観察された。このことより、水中においてはKcsAチャネルの細胞質ドメインは高速に揺らいでおり、KcsAの細胞質ドメインは水中において硬い特定の構造をとらないことが示唆された。

現在までの達成度 (区分)
現在までの達成度 (区分)

2: おおむね順調に進展している

理由

高速AFMにより、水中においてはKcsAチャネルの細胞質ドメインは高速に揺らいでおり、KcsAの細胞質ドメインは水中において硬い特定の構造をとらないことが示唆されたため、研究はおおむね順調に進行していると言える。

今後の研究の推進方策

水中で特定の構造をとらないということは、瞬間凍結で構造の動きを止める低温電子顕微鏡観察が有力ということになる。今後は電子線トモグラフィー観察の試料調製条件の検討および情報収集に重点を置いて研究を推進する予定である。

次年度使用額が生じた理由

共同研究先である沖縄科学技術大学院大学の電子顕微鏡のマシンタイムが不足していたため、当初の予定よりも試薬代、旅費等がかからなかった。

次年度使用額の使用計画

共同研究先への旅費、生化学実験器具および試薬に使用する予定である。

  • 研究成果

    (7件)

すべて 2015 2014

すべて 雑誌論文 (1件) (うち査読あり 1件、 オープンアクセス 1件) 学会発表 (6件) (うち招待講演 1件)

  • [雑誌論文] 膜内KcsAカリウムチャネルの原子間力顕微鏡による構造と動態解析2015

    • 著者名/発表者名
      角野 歩,山本大輔,炭竈享司,岩本真幸,出羽毅久,老木成稔
    • 雑誌名

      生物物理

      巻: 55 ページ: 5-10

    • DOI

      10.2142/biophys.55.005

    • 査読あり / オープンアクセス
  • [学会発表] 高速原子間力顕微鏡で見るカリウムチャネルKcsAの動的挙動2015

    • 著者名/発表者名
      Ayumi Sumino, Takayuki Uchihashi, Daisuke Yamamoto, Masayuki Iwamoto, Takehisa Dewa, Shigetoshi Oiki
    • 学会等名
      第92回日本生理学会大会
    • 発表場所
      神戸国際会議場
    • 年月日
      2015-03-21
  • [学会発表] Gating-associated clustering–dispersion dynamics of the KcsA potassium channel in a lipid membrane: Direst observation using atomic force microscopy2014

    • 著者名/発表者名
      Sumino, Ayumi; Yamamoto, Daisuke; Iwamoto, Masayuki; Dewa, Takehisa; Oiki, Shigetoshi
    • 学会等名
      The 45th NIPS Internaional Symposium, co-sponsored by The Journal of Physiology
    • 発表場所
      岡崎カンファレンスセンター
    • 年月日
      2014-11-26 – 2014-11-28
  • [学会発表] カリウムチャネルKcsAのゲート開閉と連動した膜中集合・離散2014

    • 著者名/発表者名
      角野 歩、山本 大輔、岩本 真幸、出羽 毅久、老木 成稔
    • 学会等名
      第52回日本生物物理学会年会
    • 発表場所
      札幌コンベンションセンター
    • 年月日
      2014-09-25
  • [学会発表] 原子間力顕微鏡による生体膜研究へのアプローチ2014

    • 著者名/発表者名
      角野 歩
    • 学会等名
      アサイラムAFMセミナー「blueDrive フォトサーマル励振技術」
    • 発表場所
      AP大阪駅前梅田1丁目 B1F Eルーム
    • 年月日
      2014-08-01
    • 招待講演
  • [学会発表] カリウムチャネルKcsAのゲート開閉と連動した膜中集合離散:原子間力顕微鏡で明らかになった集団的振る舞い2014

    • 著者名/発表者名
      角野 歩、山本 大輔、岩本 真幸、出羽 毅久、老木 成稔
    • 学会等名
      第24回 バイオ・高分子シンポジウム
    • 発表場所
      東京工業大学大岡山キャンパス
    • 年月日
      2014-07-14
  • [学会発表] Gating-associated clustering-dispersion behavior of the KcsA potassium channel in membrane: Direct observation by atomic force microscopy2014

    • 著者名/発表者名
      Sumino, Ayumi; Yamamoto, Daisuke; Iwamoto, Masayuki; Dewa, Takehisa; Oiki, Shigetoshi
    • 学会等名
      Single Protein Dynamics in Cellulo 2014: Spatio-Temporal, Structural and Quantitative Analyses:
    • 発表場所
      沖縄科学技術大学院大学シーサイドハウス
    • 年月日
      2014-04-10

URL: 

公開日: 2016-06-01  

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