研究課題
フタホシコオロギではこれまでにCRISPR/Cas9システムを用いて，標的ゲノム領域へ特異的に変異を導入することに成功している。標的遺伝子を時間・空間特異的にックアウトするためには，対応するシス調節領域を破壊する必要があるが，標的遺伝子の配列が長い場合やシス調節領域の特定が困難である場合が多く，単純な変異導入ではコンディショナルノックアウト系統を作製することはできない。そこで，ゲノム中からシス調節領域を大きく抜き出す実験系の確立を試みた。標的にはactin遺伝子を用いてショウジョウバエの報告を参考として実験を行ったところ，標的配列をゲノム上から抜き出すことには成功したものの，効率は大変低く実用性はなかった。そこで，新たにノックイン技術を応用したコンディショナルノックアウト法を考案した。ノックイン技術に関してはゼブラフィッシュの報告を参考とし，非相同末端結合によるノックインを試みた。条件検討の結果，フタホシコオロギにおいて初めてノックインに成功し，マーカー遺伝子をゲノムに組み込むことができた。このノックイン技術を用いてコオロギのHOX遺伝子であるabd-A, UbxにGFP遺伝子を組み込み，これらの遺伝子の発現をリアルタイムイメージングすることに成功した。現在，コンディショナルノックアウト実現のためにpiggyBacのコンポーネントが組み込まれたノックインベクターを作製し，コオロギゲノムへ導入しているところである。また，これまでHiseqを用いてゲノム解析を進めてきたが，コオロギにおいては発生に関わる遺伝子の5’側がGCリッチであることが多く，配列が明らかではない遺伝子も多い。そこで，新たにlong readの次世代シークエンサーのPacBio RSIIを用いてゲノム解析を進めている。これまでにシークエンスデータは得られており，現在Gap closing解析を行っている。
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Methods in Molecular Biology
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