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本年度は、LOTUS-PirB相互作用およびPirBの神経突起伸長阻害作用に対するLOTUSの抑制効果を検討した。
申請者は、COS7細胞に強制発現させたPirBに精製LOTUSが結合することを見出した。このLOTUS-PirB結合を更に検証するために、種々の精製LOTUSタンパク質濃度においてPirBを強制発現させたCOS7細胞に対する結合実験を行い、LOTUSとPirBとの結合親和性を明らかにした。
次に、PirBの神経突起伸長阻害作用に対するLOTUSの影響を検討した。PirBを高発現するマウス小脳顆粒細胞は神経再生阻害因子Nogoにより神経突起伸長が阻害される。また、マウス後根神経節細胞にもPirBが高発現しており、Nogoにより成長円錐崩壊が誘起される。しかしながら、これらの神経細胞にはPirBと同じリガンド分子を受容し、PirBと同様な機能を有するNogo receptor-1（NgR1）も発現しており、LOTUSがNgR1拮抗作用を有することから、PirBに対する拮抗作用を特定化できない。そこで、NgR1欠損マウスの小脳顆粒細胞および後根神経節細胞におけるNogoの応答性に対するLOTUSの影響を検討した。NgR1欠損マウス小脳顆粒細胞はNogoにより神経突起伸長が阻害されたが、精製LOTUSタンパク質を添加したNgR1欠損マウス小脳顆粒細胞ではNogoによる神経突起伸長阻害がレスキューされた。さらに、Nogoにより誘起されるNgR1欠損マウス後根神経節細胞の成長円錐崩壊が、精製LOTUSタンパク質の添加によりレスキューされることが判明した。
現在、Nogoにより誘起される、NgR1欠損マウス小脳顆粒細胞および後根神経節細胞の神経突起伸長阻害がPirBを媒介しているか否かを検証するために、電気穿孔法やウイルス感染法を用いたshRNAによるPirBノックダウン実験を遂行中である。
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