| 今後の研究の推進方策 |
滑膜に発現するconnexinファミリーはconnexin 26,32,および43がある．これらのconnexinに対するsiRNA（si-Cx26,si-Cx32）を作製し，滑膜細胞，マクロファージ，骨髄単球系前駆細胞，骨芽細胞でのsiRNAによる発現抑制効果をreal time RT-PCR法で検証する．ギャップ結合の発現阻害薬であるグルタミナーゼ阻害薬，ギャップ結合の機能的阻害剤であるヘプタノール，18β-グリチルリチン酸を用いて，同様の実験を行い，Cxファミリーの発現検討を行う．また，DAラットの滑膜から線維芽細胞を，腹腔内からマクロファージを採取し，Cx43 siRNAまたはギャップ結合阻害剤であるheptanolを添加した後，LPS刺激を行い細胞内タンパクおよび培養上清を採取する．iNOSおよびCOX-2の発現をウエスタンブロットで，炎症メディエーター（prostaglandin E2，NO），炎症性サイトカイン（TNF-α，IL-1β，IL-6），骨代謝関連因子（osteoprotegerin，cathepsin Kなど）の発現をELISAで評価する.さらにRA動物モデル（CIAラット）を作製し，Cx-siRNAsを単剤あるいは併用で投与し，経時的に滑膜組織および破骨細胞でのCxファミリーの発現について免疫染色で評価し，最も効果のあった投与方法について副作用の有無を体重変化，血液生化学検査（肝腎機能，骨髄抑制の有無），骨リモデリングへの影響で検討する．治療効果として，経時的に肉眼的関節炎スコアおよび足部体積を記録する．1週毎に関節液を採取し，NO，PGE2および炎症性サイトカインの発現について評価する．感作後28日でsacrificeしレントゲンおよびμCTにより骨破壊の程度を検討する．最後に組織切片を作成しHE染色，サフラニンO染色，および，TRAP染色により組織学的に関節破壊を解析する． 以上の結果から, ギャップ結合の制御による滑膜炎・滑膜増殖・骨破壊における治療効果を検証する予定である．
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