ＤＮＡ構造位相変換制御と修復・転写・クロマチン構造変換のカップリング

2015 年度 実施状況報告書

• 研究課題/領域番号: 26870867
• 研究機関: 国立医薬品食品衛生研究所
• 研究代表者: 堀端 克良 国立医薬品食品衛生研究所, 変異遺伝部, 研究員 (40402995)
• 研究期間 (年度): 2014-04-01 – 2017-03-31
• キーワード: DNA修復 / topoisomerase / 転写 / 複合体 / DNA損傷

研究実績の概要

DNAトポロジー変換機構で中心的な役割を担う因子の１つであるDNA topoisomerase I (TOP1)の分子制御機構の破綻は、"軸索型ニューロパチーを伴う脊髄小脳失調症"やコケイン症候群B群を引き起こす原因の１つとなるなど、TOP1制御の破綻によって細胞や個体は非常に重篤な影響を受けると予想されるがTOP1制御の分子メカニズムは不明である。細胞内でTOP1と協調的に働く因子を明らかにすることで、TOP1の細胞内での制御機構の詳細を知ることができると考え、TOP1タンパク質複合体・相互作用因子を同定し、TOP1および関連するこれらの因子がどのような分子制御機構にもとづいて細胞内で機能しているのか、そして、TOP1を介在するDNA損傷と修復の分子メカニズムを分子生物学的な研究手法を用いて明らかにすることを研究目的とする。
TOP1相互作用因子をsiRNAやshRNAにより発現抑制(ノックダウン)した条件下での細胞生物学的な解析を主としており、当該年度では昨年度と同様にノックダウンの至適条件を特に念入りに決定した。また、HAやFLAGなどのエピトープタグを付加したTOP1相互作用因子の発現コンストラクトおよび発現細胞を作成した。加えて、昨年度と同様にTOP1相互作用因子群を認識する抗体を使用したクロマチン免疫沈降法およびリアルタイムPCR法を実施し、標的遺伝子上での各因子の局在変化を解析した。

現在までの達成度 (区分)

3: やや遅れている

理由

当初計画していたFRAP解析については機器の動作不良により、至適条件の決定には至らなかった。また、TOP1相互作用因子の一部の高発現細胞では細胞増殖が著しく阻害されたため、解析に時間が掛かった。それ以外の点では概ね順調に進展した。

今後の研究の推進方策

昨年度及び当該年度に決定したTOP1相互作用因子群発現抑制条件や、エピトープタグを付加した発現コンストラクト発現細胞を用いて、当初の予定通りに研究を遂行する。加えてTOP1および相互作用因子のポリADPリボシル化にそれぞれの因子が与える影響を解析する。それぞれの因子をノックダウンした際にポリADPリボシル化に関してどのような変化が生じるのかを解析し、それぞれの因子のポリADPリボシル化に関する機能的な相関関係を明らかにする。また、転写因子との相関関係をより詳細に解析する。

次年度使用額が生じた理由

予定していた国際学会への参加を見送ったため

次年度使用額の使用計画

当初の予定より消耗品費が高額となっており、消耗品費に振り替えて使用する。

研究成果

• [雑誌論文] Evaluation of mutagenicity of acrylamide using RBC Pig-a and PIGRET assays by single peroral dose in rats. (2016)
  • 著者名/発表者名: Horibata K, Ukai A, Honma M
  • 雑誌名: Mutation Research 巻: in press ページ: in press
  • DOI: http://dx.doi.org/10.1016/j.mrgentox.2015.12.005
  • 査読あり
• [雑誌論文] Measuring Reproducibility of Dose Response Data for the Pig-a Assay using Covariate Benchmark Dose Analysis. (2016)
  • 著者名/発表者名: Johnson GE, Yamamoto M, Suzuki Y, Adachi H, Kyoya T, Takasawa H, Horibata K, Tsutsumi E, Wada K, Kikuzuki R, Yoshida I, Kimoto T, Maeda A, Narumi K
  • 雑誌名: Mutation Research 巻: in press ページ: in press
  • 査読あり / 国際共著
• [雑誌論文] The in vivo Pig-a assay: A report of the International Workshop On Genotoxicity Testing (IWGT) Workgroup. (2015)
  • 著者名/発表者名: Gollapudi BB, Lynch AM, Heflich RH, Dertinger SD, Dobrovolsky VN, Froetschl R, Horibata K, Kenyon MO, Kimoto T, Lovell DP, Stankowski Jr LF, White PA, Witt KL, Tanir JY
  • 雑誌名: Mutation Research 巻: 783 ページ: 23-35
  • DOI: http://dx.doi.org/10.1016/j.mrgentox.2014.09.007
  • 査読あり / 国際共著
• [雑誌論文] Constructive rescue of TFIIH instability by an alternative isoform of XPD derived from a mutated XPD allele in mild but not severe XP-D/CS. (2015)
  • 著者名/発表者名: Horibata K, Kono S, Ishigami C, Zhang X, Aizawa M, Kako Y, Ishii T, Kosaki R, Saijo M, Tanaka K
  • 雑誌名: J Hum Genet. 巻: 60 ページ: 259-265
  • DOI: doi:10.1038/jhg.2015.18
  • 査読あり / 謝辞記載あり
• [学会発表] Pig-a/PIGRETアッセイの短期試験としての有用性：MMS共同研究報告 (2015)
  • 著者名/発表者名: 堀端克良, 山田雅巳, 鵜飼明子, 木本崇文, 千藏さつき, 三浦大志郎, 伊東悟, 武藤重治, 宇野芳文, 真田尚和, 高島理恵,志賀野美幸,高沢博修, 濵田修一,山本美佳, 堀妃佐子, 堤絵梨, 和田邦生, 前田晃央, 菊月隆太, 荻原庸介, 京谷恭弘, 足立秀樹, 上松泰明, 吉田唯真, 成見香瑞範, 藤石洋平,福田隆之, 鈴木裕太, 後藤玄, 森田健, 本間正充
  • 学会等名: 日本環境変異原学会第44回大会
  • 発表場所: 福岡
  • 年月日: 2015-11-27 – 2015-11-28
• [学会発表] Pig-a アッセイ (2015)
  • 著者名/発表者名: 堀端克良
  • 学会等名: 哺乳動物試験研究会第67回定例会
  • 発表場所: 福岡
  • 年月日: 2015-11-26 – 2015-11-26
• [学会発表] Interlaboratory Trial of the PIGRET Assay As a Short-term Genotoxicity Test: Collaborative Study by Mammalian Mutagenicity Study (MMS) Group of Japanese Environmental Mutagen Society (JEMS) (2015)
  • 著者名/発表者名: Horibata K, Yamada M, Ukai A, Kimoto T, Chikura S, Miura D, Itoh S, Muto S, Uno Y, Sanada H, Takashima R, Shigano M, Takasawa H, Hamada S, Yamamoto M, Hori H, Tsutsumi E, Wada K, Maeda A, Kikuzuki R, Ogiwara Y, Kyoya T, Adachi H, Uematsu Y, Yoshida I, Narumi K, Fujiishi Y, Fukuda T, Suzuki Y, Goto K, Morita T, Honma M
  • 学会等名: Environmental Mutagen Society 46th Annual Meeting
  • 発表場所: New Orleans, Louisiana, USA
  • 年月日: 2015-09-26 – 2015-09-30
  • 国際学会
• [学会発表] 共同研究報告I:Pig-a アッセイ (2015)
  • 著者名/発表者名: 堀端克良
  • 学会等名: 哺乳動物試験研究会第66回定例会
  • 発表場所: 栃木
  • 年月日: 2015-06-12 – 2015-06-13