| 研究実績の概要 |
今年度の研究目標は、Claudin認識Q-bodyの遺伝子を構築し，蛋白質合成および色素修飾を行うことであった．特に，各段階において反応条件の最適化を行い，蛋白質の収量と修飾効率の最大化を試みた．具体的には，
1) Claudin認識Q-bodyの発現遺伝子の構築: 大阪大学大学院薬学研究科近藤昌夫准教授の研究グループからClaudin認識抗体遺伝子をご提供いただき，そのClaudin認識抗体のVHおよびVLを，当研究グループで開発された大腸菌細胞内Fab発現ベクターpUQ2に挿入することに成功した．pUQ2ベクターは，H鎖とL鎖それぞれのN末付近に蛍光色素修飾用のシステイン(Cys)残基が含まれたCysタグが付加されており，ダブルで色素を修飾することが可能となる．なお，C末付近にはHisタグとFlagタグが付加されており，Q-bodyの精製が容易になるという特徴を持つ．
2) 蛋白質の合成および精製: 作成した遺伝子で大腸菌SHuffle T7 express lysYを形質転換し，Fab断片を発現させた．その後，細胞質画分を回収し，Talonコバルトアフィニティカラムを用いて精製を行った．その結果，高純度で、正しくフォールディングされた可用性蛋白質を得ることに成功した．
3) 蛍光色素修飾: TCEPゲルを用いてCysタグ中のCys残基を還元させ，蛍光色素ATTO520-マレイミド, R6G-マレイミド, TAMRA-マレイミドでそれぞれ修飾を行った．その後，抗Flag抗体アガロースゲルを用いて遊離の色素を除去した．SDS-PAGEにてH鎖，L鎖両方とも修飾されたことを確認した．
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