研究課題
本研究の目的は、高次クロマチンでの相同組換えを介したDNA二重鎖切断損傷修復の分子機構を明らかにすることである。相同組換えは、その中心的酵素RAD51およびRAD54依存的に損傷を受けた領域と相同な配列が無傷のDNA鎖から検索され、その配列をもとにDNA二重鎖切断損傷が修復される。真核生物の細胞核内に収納されているゲノムDNAはクロマチン構造を形成し、細胞核内に収納されているが、クロマチン上での相同組換えの反応機構は分かっていない。本年度は、クロマチン高次構造制御に重要なリンカーヒストンH1に着目し、生化学的および細胞生物学的な解析を行った。ヒトのH1には11種類のバリアントが存在するが、H1バリアントが形成する多様な高次クロマチン構造と相同組換えの関係は分かっていない。そこで、様々なH1バリアントを含むクロマチンを試験管内で再構成し、それらを基質としてRAD51およびRAD54依存的な相同組換え反応を解析した。その結果、H1バリアントを含むクロマチンは相同組換え反応に阻害的に働くが、興味深いことに、精母細胞で高発現しているH1Tが他のH1バリアントと比較して、相同組換え反応の阻害効果が著しく低いことが明らかになった。精母細胞は、減数分裂を経て精子となるが、その減数分裂の進行には相同組換えによるキアズマの形成が必須である。精母細胞特異的に発現するH1Tは、相同組換えのための「場」としてのクロマチン構造形成に機能することが予想された。加えて、相同組換えの進行に必須である120番目のリジンがユビキチン化されたヒストンH2B(H2BK120ub)を化学的に合成し、H2BK120ubを含むヌクレオソームを試験管内で再構成した。さらに再構成したH2BK120ubヌクレオソームの結晶化を行い、良質な単結晶を得ることに成功し、3.3オングストロームでX線回折データを得た。
1: 当初の計画以上に進展している
本年度の研究により、リンカーヒストンバリアントおよびユビキチン化ヒストンを含む多様なクロマチンを試験管内で再構成する技術を確立した。さらに、その技術を用いて、RAD51およびRAD54依存的な相同組換え試験系の確立に成功した。これら確立した技術は他のコアヒストンバリアントやヒストン修飾体の解析に直接応用出来る。また、これらの技術により、精巣特異的リンカーヒストンバリアントH1Tの相同組換え抑制効果が、他のH1バリアントと比較して弱いことを明らかにした。加えて、ユビキチン化ヒストンを含むヌクレオソームの結晶化に成功し、3.3オングストロームでX線回折データを得ることに成功している。これらのことから、本年度の研究が当初の計画以上に進展していると考えた。
本年度の研究により、ヒストンH1バリアントの中で、H1Tによる相同組換え反応の抑制効果が著しく弱いことが明らかになった。このことは、精母細胞特異的に発現するH1Tが相同組換えのための「場」としてのクロマチン高次構造形成に機能することを示唆する。今後は、H1Tを含むクロマチンの高次構造を分析超遠心法やヌクレアーゼを用いた試験により解析し、クロマチン高次構造と相同組換えの関係の詳細を明らかにする。並行して、H2BK120ubヌクレオソームの構造解析を行い、ヒストンのユビキチン化によるクロマチン高次構造制御機構を原子レベルで解明する。加えて、H2BK120ubを含むポリヌクレオソームを試験管内で再構成し、RAD51およびRAD54依存的な相同組換え反応への影響を解析する。これらの結果から、ユビキチン化ヒストンによる相同組換えの制御機構を明らかにする。
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