| 研究実績の概要 |
①三次元培養による骨細胞特異的miRNAの機能評価
前年度に骨細胞特異的miRNAの網羅的解析を行い、二次元培養条件下において骨細胞分化調節を制御するmiRNAを同定した。今年度は、生体内により近い三次元環境下においてmiRNAが骨細胞分化能に与える影響を明らかにするため、コラーゲン・ゲル包埋培養法を用いた三次元培養を確立し、miRNAの過剰発現あるいはノックダウン試験を行った。その結果、三次元培養においても骨細胞分化能を調節するmiRNAが存在していることが明らかとなった。二次元培養での骨細胞分化の傾向と比較検討することにより、これまで同定していたmiRNAの中から、骨細胞分化調節において特に重要なmiRNAの絞り込みに成功した。
②骨細胞特異的miRNA標的遺伝子の同定と転写調節の解明
前年度までに同定したmiRNAの標的候補遺伝子をtarget scan, pictar等のデータベースを用いてin silicoで解析を行った。二次元骨細胞培養において、miRNAの過剰発現あるいはノックダウン試験を行い、miRNA標的遺伝子の蛋白発現をウエスタンブロッティングにより評価した。その結果、複数の標的候補遺伝子の中から、骨細胞特異的miRNAにより発現が変化する標的遺伝子の絞り込みに成功した。また、標的遺伝子に関連するシグナル伝達経路に着目し、ルシフェラーゼアッセイによる転写調節の解析を行った。以上より、骨細胞分化を制御するmiRNAの転写調節メカニズムの一端が明らかとなり、今後の骨細胞研究の進展に繋がる成果が得られたと考えられる。
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