| 研究実績の概要 |
前年度までに薬物代謝酵素(CYP2C9, CYP2C19, CYP2D6, CYP3A4)および還元酵素PORを搭載した人工染色体保持CHO細胞を作製した。本年度はこの人工染色体を別細胞へと移入したときに、その細胞内において人工染色体が正常に機能することを確認した。
本研究にて用いた人工染色体移入のためのホスト細胞は代表者が所属する研究室において、その実績があるHT1080細胞株を用いた。導入の方法は、前年度作製したドナーCHO細胞に麻疹ウイルスエンヴェロープを一過性に発現させた後に、微小核融合法を用いてHT1080細胞と人工染色体含有微小核を融合させた。その後、人工染色体保持HT1080細胞を取得することを目的として、予め人工染色体に搭載しているネオマイシン耐性遺伝子を利用しG418にて選択培養を行った。最終的に3株のG418耐性クローンを取得した。その後、取得したG418耐性クローンの中で増殖が速い1クローンについてFISH解析を行ったところHT1080細胞のホスト染色体の他に、目的遺伝子を搭載した人工染色体を示すシグナルが認められた。加えて、CYP2C9, CYP2C19, CYP2D6, CYP3A4およびPORの遺伝子発現量をreal-time PCRにて解析を行ったところ、トランフェクション前に発現が認められなかったCYP2C9, CYP2C19, CYP2D6, CYP3A4およびPORの発現が有意に高くなることが認められた。また免疫染色にて解析するとすべての細胞にて一様に発現することが認められた。これらの結果から本課題にて開発した人工染色体は別細胞へと移入した際に機能することを示した。
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