| 研究概要 |
1.特異抗体の精製:AT【III】,F【IX】,F【X】に対するそれぞれの抗血清を33%硫安沈澱させ0.1MNaclを含む10mMリン酸緩衝液(pH7.0)で透析後、同じ緩衝液で平衡化された抗原結合Sepharose 4Bカラム(AT【III】-Sepharose 4B,F【IX】-Sepharose 4B,F【X】-Sepharose 4B)にアプライした。同緩衝液で十分に洗浄後、1MNacl、0.1%Na【N_3】を含む0.1Mglycine-HCl緩衝液(pH2.5)にて溶出し直ちに5NNaOHにて中和した。これをオクタロニー法にて検定した。
2.ポリスチレンボール結合一次抗体の調製:精製特異抗体IgGはpepsin(from porcine stomach mvcosa sigma社製)を用いてF【(ab')_2】画分した。これにポリスチレンボール(直径3.18mm、Precision Plastic Ball社製)を一昼夜つけ、その後、0.1MNaCl、1mMMg【Cl_2】、0.1%BSA、0.1%Na【N_3】を含む10mMリン酸緩衝液(pH7.0)でブロックした。
3.β-D-ガラクトシダーゼ標識Fab'の調製:加藤らの方法に従い、N-N'-O-phenylenedimale-imideを用い、β-D-galactosidase(from,Ecoli.Boehringer Mannheim社製)を精製特異抗体Fab'に結合させた。4.精製系における【IX】a-AT【III】の測定:精製F【IX】(350Mg/ml)0.8mlとRVV-X-Sepharose4B(0.05mgRVV-X/mlゲル)1ml、1MCa【Cl_2】0.015mlを37℃、3時間反応させた。この【IX】a 25μl(8.75μg)、AT【III】25ml(12.5μg)Heparin 1Uを37℃で1時間反応させた。これをサンプルとして複合体標準曲線を作製した。
5.精製系におけるXa-AT【III】の測定:精製F【X】(800μg/ml)0.8mlとRVV-X-Sepharase4B、1ml、1MCa【Cl_2】0.015mlを37℃、30分間反応させた。このXa25μl(20.0μg)、AT【III】25μl、Heparin 【IX】を37℃で1時間反応させた。これをサンプルとして複合体標準曲線を作製した。
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