| 研究概要 |
1.マウス(C57BL/6J系)の皮膚から分離、培養し樹立した培養細胞TM10をマウスの腹腔に注射し、増殖させた細胞塊からRNAを抽出しオリゴdTセルロースカラムを用いてポリ【(A)^+】RNAを分離した。このポリ【(A)^+】RNAから逆転写によってCDNAを合成し、λgt11ベクターに組換えて、500bp以上の長さのDNAをもつクローンを約20万分離した。この中からチロシナーゼ遺伝子の配列を含むクローンを選択するために、先づ抗チロシナーゼ抗体を用いてスクリーニングを行い、チロシナーゼタンパク質を発現していると思われるクローンを6個分離した。次に夫々のクローンにつき、cDNAをEcoRI製限酵素で切断し、電気泳動した結果、同一のバンドを示したクローンを除外し、最終的に4種類のクローン(塩基配列の長さは夫々1.25kb,0.9kb,1.9kbおよび0.2kb)を選択した。次に、B16マウスメラノーマより分離情製したチロシナーゼの2ケ所のアミノ酸配列から、それに対応する14merと21merのヌクレオチドを合成し、それをプローグとして上記の4クローンとのハイブリダイゼーションを行った結果、その中の3クローンが陽性であった。
從って、これらのクローンはチロシナーゼ遺伝子の配列を含むcDNAであると考えられる。
2.このcDNAをプローグとして、培養色素細胞TM10および培養アルビノ色素細胞,正常マウス皮膚,肝臓においてチロシナーゼmRNAが発現しているか、ドット・ハブリダイゼーションによって検定を行ったところ、肝臓を除き、陽性であった。このことはアルビノ色素細胞がCRMのmRNAを合成していることを意味する。
3.これらのcDNAをDNAとして培養アルビノ細胞に導入したところ、約【10^(-6)】の頻度で形質転換をおこす細胞が出現した。現在胚細胞への導入を継続行っている。
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