タンパク質の膜透過・分泌の機構

1989 年度 実績報告書

• 研究課題/領域番号: 61060001
• 研究機関: 東京大学
• 研究代表者: 水島 昭二 東京大学, 応用微生物研究所, 教授 (50013313)
• 研究分担者: 市原 茂幸 名古屋大学, 農学部, 助手 (30092993) ; 山田 寿美 名古屋大学, 農学部, 教務職員 (30089859) ; 内田 欣哉 東京大学, 応用微生物研究所, 助手 (60013330) ; 松山 伸一 東京大学, 応用微生物研究所, 助手 (50183108)
• キーワード: タンパク質の分泌 / タンパク質の膜透過 / SecA / ATP / シグナルペプチド / 大腸菌 / ビブリオ菌 / 膜タンパク質

研究概要

1)膜透過に関与する因子の機能解析:精製SecAおよびSecA断片を用いて、ATPとの相互作用、分泌型タンパク質との相互作用におけるSecAの各ドメインの役割を明らかにした。またSecAが二量体を形成していることを明らかにした。
2)膜透過過程の反応速度論的解析:1分子の分泌型タンパク質が膜を通過する過程を解析する目的で、繰返し構造をもつ巨大人工タンパク質をコードする人工遺伝子を作成した。しかし、in vitroで効率よく膜透過させることには成功していない。
3)膜透過反応へのエネルギーの関与:ATPがSecAのN末近くと相互作用することを明らかにした。またΔμ^^ーH^+はATPの分泌装置(恐らくはその中のSecA分子)に対する親和性を高める働きをしていることを明らかにした。
4)分泌型タンパク質の構造と膜透過性:シグナルペプチドのN末端正荷電の重要性を明らかにした。また中央部疎水領域の特性、同領域とN末端領域が機能的に関連しあっていることを、人工シグナルペプチドを用いて明らかにした。
5)タンパク質と膜との相互作用:シグナルペプチドの膜内配向性についての研究成果をもとに、膜タンパク質の膜内配向性を決定する因子として、疎水領域とそれに隣接する正荷電の組合せが重要であることを、in vitro実験によって示した。
6)再構成系を用いての解析:膜透過再構成系の作成に成功した。リン脂質、膜構造、膜タンパク質、SecY、SecA、ATPが必要なことを再構成系で示すことに成功した。
7)ビブリオ菌でのin vitro膜透過系をつくることに成功し、この細菌特有のNa^+ポンプが膜透過に関与することを示した。

研究成果

• [文献書誌] Kawasaki,H.;Matsuyama,S.;Akita,M.;Mizushima,S: "SecA protein is directly involved in protein secretion in Escherichia coli." FEBS Letters. 242. 431-434 (1989)
• [文献書誌] Yamada,H.;Tokuda,H.;Mizushima,S.: "Proton motive force-dependent and -independent protein translocation revealed by an efficient in vitro assay system of Escherichia coli." J.Biol.Chem.264. 1723-1728 (1989)
• [文献書誌] Matsuyama,S.;Mizushima,S.: "Energy-dependent in vitro translocation of a model protein into Escherichia coli inverted membrane vesicles can take place efficiently in the complete absence of the cytosol fraction." J.Biol.Chem.264. 3583-3587 (1989)
• [文献書誌] Ichige,A.;Matsutani,S.;Oishi,K.;Mizushima,S.: "Establishment of gene transfer systems for and construction of the genetic map of a marine Vibrio strain." J.Bacteriol.171. 1825-1834 (1989)
• [文献書誌] Shinkai,A.;Yamada,H.;Mizuno,T.;Mizushima,S.: "Insertion of signal peptide-derived hydrophobic segment into the mature domain of OmpC,an outer membrane protein,does not interfere with the export of the following polypeptide chain across the cytoplasmic membrane of E.coli." J.Biochem.106. 323-330 (1989)
• [文献書誌] Yamada,H.;Matsuyama,S.;Tokuda,H.;Mizushima,S.: "A high concentration of SecA allows proton motive force-independent translocation of a model secretory protein into E.coli membrane vesicles." J.Biol.Chem.264. 18577-18581 (1989)
• [文献書誌] Tani,K.;Shiozuka,K.;Tokuda,H.;Mizushima,S.: "In vitro analysis of the process of translocation of OmpA across the Escherichia coli cytoplasmic membrane." J.Biol.Chem.264. 18582-18588 (1989)
• [文献書誌] Sasaki,S.;Matsuyama,S.;Mizushima,S.: "In vitro kinetic analysis of the role of the positive charge at the amino-terminal region of signal peptides in translocation of secretory protein across the cytoplasmic membrane in Escherichia coli." J.Biol.Chem.
• [文献書誌] Mizushima,S.;Tokuda,H.: "In vitro translocation of bacterial secretory proteins and energy requirements" J.Bioenerg.Biomemb.
• [文献書誌] Akita,M.;Sasaki,S.;Matsuyama,S.;Mizushima,S.: "SecA interacts with secretory proteins by recognizing the positive charge at the amino-terminus of the signal peptide in Escherichia coli." J.Biol.Chem.