水素交換法によるタンパク質の中間構造状態の特性化

1989 年度 実績報告書

• 研究課題/領域番号: 61420050
• 研究機関: 北海道大学
• 研究代表者: 須貝 新太郎 北海道大学, 理学部, 教授 (80000727)
• 研究分担者: 桑島 邦博 北海道大学, 理学部, 助手 (70091444) ; 新田 勝利 北海道大学, 理学部, 講師 (80001858)
• キーワード: 折れたたみ中間体 / 構造のゆらぎ / H【double arrow】D交換 / 高速CD測定 / モルテングビュ-ル / αーラクトアルブミン / トリプトファン合成酵素 / スタフィロコッカルヌクレア-ゼ

研究概要

αーラクトアルブミン(αーLA)の変性中間体のゆらぎが大きい事をH→D交換法で調べた昨年度迄のデ-タをまとめ、不備な点を再評価するとともに、本年度はCa結合リゾチ-ム(LYZ)の変性中間体および他の蛋白質にも仕事を進めた。馬のLYZの天然状態とアポ状態を二次元^1HーNMRで特性化し、いくつかのTrpおよびTyrのプロトンの位置の同定、Ca^<2+>ー結合による移動を明らかにした。鳩のLYZの天然状態は見掛けはCa^<2+>結合度に関係せず、しかし安定性は[Ca^<2+>]によった。不思議な事にその変性はいつでも二状態間変性であった。αーLAに似ているCa結合LYZで馬はαーLAに性質が似ていて、一方鳩では全くニワトリLYZに似るのは何故か?今後の重要な課題である。
一方トリプトファン合成酵素のβ_2ザブユニツトの5M尿素からのジャンプでまきもどりを高速CDで調べた。装置の不感時間内に〜60%の二次構造が生成、その後ゆっくりと三次構造が生成する。Ptitsynらの蛍光色素を使ったデ-タと併せて、まきもどりの初期にモルテングロビュ-ル中間体が出来ると結論出来、IgG19を認識する抗原サイトは天然状が出来る前のゆらぎの大なる状態で既に出来ていると考えうる興味ある結果を得た。
又スタフィロコッカル・ヌクレア-ゼのまきもどりを高速CDとH→D交換で調べた。まきもどりの初期に二次構造はあまり生成せず(〜25%)H→D交換からの結論もこれを支持するものだった。しかし酸側平衡中間体のCDは、多少の二次構造の存在を示した。この場合は中間体が不安定なのかも知れない。
4年間続いた仕事のまとめとして、モルテングロビュ-ル状の安定性が、アミノ酸配列に敏感である事、αーLAはそれが安定でまきもどりの過程を特色ずけられる好適な試料である事が解った。

研究成果

• [文献書誌] K.Kuwajima,M.Jitani and S.Sugai: "Characterization of the Critical state in Protein Folding:Effects of Guanidine Hydrochloride and Specific Ca Binding on the Folding Kinetics of alpha-Lactalbumin" J.Molecular Biology. 206. 547-561 (1989)
• [文献書誌] Y.Harushima and S.Sugai: "Hydrogen Exchange of the Tryptophan Residues in Bovine,Goat,Guinea Pig,and Human alpha-Lactalbumin" Biochemistry. 28. 8568-8576 (1989)
• [文献書誌] K.Kuwajima: "The Molten Globule State as a Clue for Understanding Folding and Cooperativity of Globular Proteins" Proteins:Structure,Function and Genetics. 6. 87-103 (1989)
• [文献書誌] J.Desmet,H.Van Dael,F.Van Cauwelaert,K.Nitta and S.Sugai: "Comparison of the Binding of Ca^<2+> and Mn^<2+> to Bovine Alpha-Lactalbumin and Lysozyme" J.Inorganic Biochemistry. 37. 185-191 (1989)
• [文献書誌] M.E.Goldberger,G.V.Semisotonov,B.Friguet,K.Kuwajima,O.B.Ptitsyn and S.Sugai: "An Early Immunoreactive Folding Intermediate of the Tryptophan Synthase beta_2 subunit is a “Molten Globule"" FEBS Letters. (1990)
• [文献書誌] E.A.Permyakov,V.M.Grischenko,L.P.Kalinichenko,N.Y.Oriov,K.Kuwajima and S.Sugai: "Calcium-regulated Interaction of Human alpha-Lactalbumin with Bee Venom.Melittin" Biophysical.Chemistry. 35. (1990)
• [文献書誌] S.Sugai,K.Nitta and H.Tsuge: "Second Forum on Peptides (Colloque Inserum Vol.174)" John Libby,Eurotext,London Paris, 612 (1988)
• [文献書誌] S.Sugai,K.Kuwajima and K.Nitta: "Protein Structural Analysis,Folding and Design(ed.M.Hatano)" Japan Scientic Society Press,Elsevier, 237 (1990)