| 研究概要 |
1.好熱性細菌のLー乳酸脱水素酵素(LDH)遺伝子のクローニング、配列決定と大腸菌での大量発現
高度好熱性細菌Thermas caldophilus GK24のLDHの遺伝子を大腸菌にクローニングして、そのDNAの塩基配列、及び蛋白質のアミノ酸配列を決定した。また、この遺伝子と大腸菌のプロモーター間の配列を改良して酵素の大量発現を行い、変異酵素を容易に得られる系を開発した。
2.制御部位の解析
本酵素のアミノ酸配列と化学修飾の結果を脊椎動物のLDHの結晶解析による立体構造を参照して解析し、脊椎動物LDHにおいて、アニオン結合部位といわれている部位が制御部位であることを明らかにした。
3.部異特異的変異による変異酵素の取得とその制御特性の解析
上記の系を用い、制御部位に存在するアミノ酸残基、His-188、Arg-216、Arg-256、Arg-259、Gly-267、Tyr-269を合成デオキシヌクレオチドを用いた部位特異的変異によりGln-173(173Q)、Lys-173(173K)、Glu-173(173E)、Phe-188(188F)、Glu-216(216E),Asp-256(256D)、Gln-256(256Q)、Gln-259(259Q)、Arg-267(267R)、His-269(269H)および多重変異の256D/267R、173Q/256D/267R等の各種酵素を取得し、Arg-173、His-188、Arg-259の正電荷がアロステリック・エフェクターであるフルクトース1,6ー二燐酸(FBp)の結合に必須であることなど、制御機構におけるこれら残基の寄与を明らかにした。
3.核磁気共鳴(NMR)を用いた酵素制御過程における蛋白質構造変化の解析
TRNOEの手法をもちいて、酵素に結合した補酵素の立体構造の変化を測定し、補酵素のニコチンアミド環の立体配座を変化させる蛋白質構造変化の制御への関与を明かにした。
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