| 研究課題/領域番号 |
61470143
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| 研究機関 | 札幌医科大学 |
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研究代表者 |
佐々木 輝捷 札幌医大, 医学部, 助教授 (00045494)
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| 研究分担者 |
山田 恵子 札幌医科大学, 医学部, 助手 (80045541)
阿部 晃 札幌医科大学, 医学部, 助手 (70136927)
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| キーワード | 糖脂質移送タンパク質 / 細胞内局在部位 / 腎上皮細胞株 / 免疫組織化学 / 免疫アッセイ / ブロムシアン分解 |
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| 研究概要 |
1.糖脂質移送タンパク質(GL-TP)の細胞内局在部位。精製GL-TPにより家兎を免疫して得た多クローン性抗体を用いて、SDS-PAGEで分離したGL-TPを特異的に検出した。ブタ脳粗抽出液細胞上清に存在するGL-TPを分子量2万2千のバンドとして検出できた。ブタ脳GL-TPに対する家兎抗体は、ラット脳GL-TPとも交差反応したが、ラットGL-TPの分子量はブタGL-TPのそれよりも小さかった。GL-TPは、ブタ腎上皮細胞株PK(15)細胞にも存在した。PK(15)細胞を窒素気胞化細胞破砕法で破砕した所、GL-TPは細胞上清に見い出され、細胞小器官画分には見い出されなかった。この結果から、GL-TPは細胞質に存在するタンパク質であると考えられる。蛍光抗体法を用いたPK(15)細胞内におけるGL-TPの局在性の検討も、この結果を支持している。
2.ブタ脳組織におけるGL-TPの免疫組織化学的検出。GL-TPのブタ脳組織内分布を検討した。神経細胞ばかりではなく、グリア細胞にも検出され、特に小脳プルキンエ細胞に強く検出された。
3.GL-TPの免疫アッセイ法の開発。GL-TPの免疫アッセイを、原理の異なる二種類のELISAにより検討した。抗GL-TP多クローン性抗体を用いた免疫アッセイ法は定量性において不十分なため、単クローン性抗体を用いてGL-TPの免疫アッセイを検討している。液体窒素保存容器と細胞数計測装置は、GL-TPに対する単クローン性抗体の調製に使用した。
4.GL-TPをコードするmRNAに対するcDNAのクローニング。GL-TPのアミノ末端に遊離アミノ基は検出されなかった。GL-TPをBrCNを用いて断片化し、各ペプチド断片を逆相カラムを用いた液体クロマトグラフィーにより分離・精製し、得られたペプチド断片のアミノ酸配列を検討した。この配列に基づき、核酸プローベを合成する。
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