超微量(f-モル)蛋白質のアミノ酸配列決定法の研究

1988 年度 実績報告書

• 研究課題/領域番号: 61470160
• 研究機関: 東京理科大学
• 研究代表者: 次田 晧 東京理科大学, 総合研究所生命科学研究部門, 教授 (00028284)
• 研究分担者: 佐竹 一夫 東京理科大学, 理学部I部・化学化, 教授 (20096704)
• キーワード: 超微量アミノ酸配列 / 蛋白質N末端配列決定法 / 高感度化 / 0.1fモル蛍光アミノ誘導体 / アミノフロレセイン

研究概要

超微量蛋白質の解析、特にアミノ酸の配列決定法の微量化は、細胞分子生物学の広範な領域でのニーズが高まっている。この目的のため過去二年間に恒りエドマン法で出来る中間をアミノフロレセインに反応させ、主反応、即ち配列決定収量等を妨げる事なく、最終産物を高感度化する研究を進めている。本年度は先ずHPLCによる20種のアミノ酸誘導体の分離を行った。この過程で溶媒を高いPHにすることによって従来の感度1fモルを約10倍の100アトモルに上げることに成功した。従って高pH耐性カラムを用い、上述の分離を完成した。又今迄に二種類のアミノ酸誘導体について行って来た反応収率の検討と、反応生成物の安定性を20種の全てのアミノ酸について行った。収率についてはグルタミン酸、ヒスチジン、アルギニンら3種の極性アミノ酸が40%前後であったほか全てのアミノ酸については100%前後の高収率を示した。安定性は20種アミノ酸全部が非常に安定である事が判った。次いで現在汎用されているABIシーケンサーに蛍光試薬アミノフロレセインを加え、10Pモル、1Pモルの蛋白質について実際に機械を動かして機器の調整及びプログラムの改良を行った。これらの改良によって1Pモルの蛋白質試料の10段階のアミノ末端解析が可能となった。又これ以下のサンプル量では、試料の保持機構、機器、特にコンバートフラスコの形状等から現シーケンサーではほぼ不可能な事が証明された。この事は検出限度が0.1fモルである事との間に大きな隔りがあり、機器そのものの改良、試作が必須とされる。この方向に向っての努力を、球形保持体等を用いて基礎研究を継続していく。又当高感度化反応に伴って3つの副生成物が前述の20種のアミノ酸ピークの分離ピークの他に見出され、第一のピークは残存PITCから、第二のものはTFAから、第三のものは蛍光試薬そのものから出て来る事が判り、第二のピークを除いては全て消去できた。

研究成果

• [文献書誌] S.Yokio 他: J.Amer.Soc.Brewing.Chem.46. 99-103 (1988)
• [文献書誌] A.Tsugita 他: J.Biochem.103. 399-401 (1988)
• [文献書誌] H.Nagashima 他: Prot.Seq.Data Anal.
• [文献書誌] M.Kamo 他: Prot.Seq.Data Anal.
• [文献書誌] K.Satake 他: Prot.Seq.Data Anal.
• [文献書誌] A.Tsugita 他: J.Biochem.
• [文献書誌] A.Jacq 他: J.Bact.
• [文献書誌] M.Kamada 他: Chem.Pharm.Bull. 46. 99-103 (1988)
• [文献書誌] A.Tsugita 他: J.Prot.Chem.7. 316 (1988)
• [文献書誌] M.Kamo 他: Peptide Chemistry. (1988)
• [文献書誌] Y.Nozu 他: Prot.Seq.Data Anal.
• [文献書誌] A.Tsugita 他: J.Prot.Chem.
• [文献書誌] 次田晧: 化学と生物. 26. 330-337 (1988)
• [文献書誌] 次田晧: 化学と生物. 26. 404-411 (1988)
• [文献書誌] 次田晧: 26. 1988. (456-464)
• [文献書誌] A.Tsugita 他: "Purification and characterization of micro quantities of protein.Protien Structure Function Relationship Elsevier Pub.BV ed." Pergamon Press, 309-313 (1988)
• [文献書誌] A.Tsugita 他: "Approaches for Microsequencing Proteins:structure and function" Plenum Pub.Co.New York, 315-322 (1987)
• [文献書誌] A.Tsugita 他: "Strategies for the manipulation and sequencing of micro quantities of protein."The Seventh seminar on Science and Technology;Mol.Biol."" 43-55 (1987)
• [文献書誌] A.Tsugita 他: "Protein structure-function relationship" Karachi Univ.Press, 6 (1988)
• [文献書誌] 次田晧: "タンパク質・ペプチドの高速液体クロマトグラフィー超高感度ATZ-アミノ酸の誘導化" 化学同人, (1989)