| 研究概要 |
本年度は、遺伝性オロット酸尿症で欠損している二つの酵素,オロット酸ホスホリボシールトランスフェラーゼ(OPRT)とオロチジル酸脱炭酸酵素(ODC)のうちODCをヒトの赤血球から抽出し、精製した。方法は、ヒトの血液を0.155MKC1で3回洗った後、沈査の赤血球を5mMのリン酸カリウム緩衡液(KPB)で溶血させ、1.2Mの硫酸アンモニウムを加えて、9,000G,20分間遠心して、この上清を酵素液とした。この酵素液を次に5段階の精製過程を経て精製した。精製は、第一段階はOctyleminosepharoseカラム,第二段階はCM-Sepharoseカラム,第三段階はhydroxylapatiteカラムとHCA-カラム,第四段階はMono Q pre-packed カラムHR5/5,第五段階はMono S pre-packed カラムHR5/5を用いた。各段階での活性のあるフラクションは、【^(14)C】-OMPから生じる【^14CO-2】を測定して同定した。以上の精製過程により、蛋白量600gのヒト赤血球溶血液より蛋白量0.3mg,specific activity 2.00×【10^(-2)】U/mg proteinのODC活性が約1万倍に濃縮された酵素が得られた。ODCの酵素は、以上の精製過程で、非常に不安定で精製が因難であったが、精製の第二,第三及び第四段階に1mMのウリジン-5'-1燐酸を加えることにより、安定化させることができた。現在は、得られた酵素をSDSピェージで電気泳動後、分子量51,000のバンドを切り出し、アジュバンドと共にウサギに免疫して、ODCに対する抗体を作製している。
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