| 研究概要 |
ヒトβーグロビン遺伝子の正確な転写開始に関与する6つの蛋白因子のうちFr.AおよびFr.Cについて更に精製を試みた. Fr.AについてHeLa細胞核抽出液よりDEAーセファローズ,フォスホセルローズ,SPーTOYO,ゲル瀘過及びCMーHPLCカラムにより,銀染色上90%以上の純度の標品約20μgを得た. 分子量はSOSーPAGEより2.7万と推定され,ゲル瀘過法で得られた5.2万の分子量と比較する時,ダイマーで存在することが示唆された. 一方Fr.Cについて核抽出液よりDEAEーセファローズ,フォスホセルローズ,DEAEーTOYO,ゲル瀘過,DEAEーHPLCおよびゲル瀘過により銀染色上80%以上の純度の標品約20μgを得た. SDSーPAGE上約12万と4万の2つのバンドからなっていた. βーグロビンのTATA領域のDNA配列をもつオリゴDNAを合成し,プローブとしてゲルシフト法によりアッセイすると,Fr.Cはそれに結合することが明らかとなった. ウエスターンブロッティング法により,2つのバンドのうち12万のそれがDNAとの結合に関与していることが判明した.現在Fr.CのDNAへの結合がTATAボックスに特異的か否かフットプリンティング法などの方法で検討している. またこの合成DNAのポリマーを作った後,BrCN活性化セファローズに結合させアフィニティーメディアを作製し,Fr.Cの精製を試みた. その結果Fr.Cを精製することができたたが,その標品はDNA結合能をもっていたが転写活性が認められなかった. 現在この理由は不明である. 転写開始に必要な蛋白因子,Fr.AおよびFr.Cについて精製法が確立したので,それらのクローニングに必要な情報を得るために精製標品の蓄積およびアミノ酸配列の沢定に着手した.
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