| 研究課題/領域番号 |
61560149
|
|---|
| 研究機関 | 九州大学 |
|---|
研究代表者 |
松本 清 九大, 農学部, 助教授 (80038322)
|
|---|
| 研究分担者 |
中島 正利 九州大学, 農学部, 教務員 (20091382)
筬島 豊 九州大学, 農学部, 教授 (00038184)
|
|---|
| キーワード | 補酵素の再生 / 固定化補酵素 / メディエーター / 脱水素酵素の固定化 / フローインジェクション分析 |
|---|
| 研究概要 |
1.NADの固定化 NADをグルタルアルデヒド(GA)活性化Sepharose(GA-Seph)に直接結合させる方法を検討した。結合ヌクレオチド量はリンの定量により、また補酵素活性はアルコールデヒドロゲナーゼ(ADH)を用いて測定した。NADのGA-Sephへの固定化量は、pHにより大きく影響され、pH3とpH8では明らかにその結合様式に違いが認められた。水素化ホウ素ナトリウムによる担体上のアルデヒド基の還元、あるいは各種のアデニン含有ヌクレオチドの固定化量の比較等から、pH3において、GA-SephへのNADの結合は、担体上のアルデヒド基とNADのアデニン環環外アミノ基との間で生じていることが示唆された。一方、pH8においては、AH-Sephに直接NADが結合することからその結合がイオン的な相互作用であるものと考えられた。pH3及びpH8で固定化されたNADのVmaxは遊離のNAD(1.0)に対して各々0.51及び0.85であり、十分な補酵素活性を有していることが認められた。
2.ADHとNADの同時固定化 酵素・補酵素間の共役効率の向上のためにヘキサメチレンジアミン(HMDA)及びGAを交互に反応させることによりスペーサーを導入した。導入されたスペーサー長は、ADH,NAD同時固定化ゲルの再利用性に大きな影響を有していた。即ち、HMDAとGAの反応をCNBr-活性化Sepharaseに3回繰り返すことにより調製した【R_3】-Sephが、再利用性及び調製に要する時間の点から、最適なスペーサー長を有していると考えられた。さらに、【R_3】-Sephの再利用性はGAの反応条件に大きく依存していることが認められた。最適条件でGAを反応させて調製した【R_3】-Sephはエタノールに対する5回の繰り返し測定後も活性の減少は認められず、エタノールに対して十分な定量性を有していた。
|
