| 研究概要 |
ピリミジンヌクレオチドde novo合成経路の初段3酵素はCPSase(カルバミルリン酸合成酵素),ACTase,DHOaseと略記する。61年度の研究達成目標はモデル試料としてCrithidia fasciculataの培養型虫体を用い、3酵素を精製し、酵素学的性質および調節酵素としての役割について検討することであった。そのためにまずC.fasciculataをLIT培地中で大量培養し、グリセロール,蛋白分解酵素阻害剤,SH保護剤を含むリン酸バッファ中でホモジナイズし、その遠心上清について硫安分画を行なったところ、CPSaseは33-50%画分に、ACTaseは50-80%画分に沈澱した。すなわちこれらの酵素は哺乳類や寄生蠕虫にみられるmultifunctional proteinとは異なり、それぞれ独立の酵素であることが明らかとなった。したがって、特に初段酵素である点を重視してCPSaseにフォーカスをしぼって研究を進め、CrithidiaのCPSaseはグルタミン依存性のCPSase【II】型の酵素であり、酵素学的性質は哺乳類・寄生蠕虫のものと異なり、原核生物タイプに似ており(Comp.Biochem.Physiol.,印刷中)、ピリミジン合成経路の調節酵素として機能し、UDP,UTPにより強いフィードバック阻害を受けるが、動物・蠕虫の場合と異なりPRPPによる活性化はみられない(Comp.Biochem.Physiol.,印刷中)等の特徴を認めた。さらにグルタミン拮抗剤(抗腫瘍剤でもある)acivicinの作用をin vitroで調べた。AcivicinはCPSaseのグルタミン依存性活性を拮抗阻害するが、グルタミン非添加の条件では同活性を時間依存的・不可逆的に不活性化すること、すなわちactive site-directed affinity analogとして作用し、affinity labelingのメカニズムによりCPSaseを失活させることを明らかにした(Mol.Biochem.Parasital.,印刷中)。次に無血清培地を用いてCrithidiaを培養し、acivicinの添加効果を解析したところ、この抗腫瘍剤はCrithidiaの増殖を著しく阻害したので、その標的酵素の検索もおこなった。Acivicinはin vivoでもCPSaseを不活性化した(投稿中)。
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