| 研究課題/領域番号 |
61570472
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| 研究機関 | 東京慈恵会医科大学 |
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研究代表者 |
伊藤 文之 東京慈恵会医科大学, 小児科, 講師 (10057010)
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| 研究分担者 |
大橋 十也 東京慈恵会医科大学, 小児科, 助手 (60160595)
多田 有希 東京慈恵会医科大学, 小児科, 助手 (10179707)
井田 博幸 東京慈恵会医科大学, 小児科, 助手 (90167255)
田原 卓浩 東京慈恵会医科大学, 小児科, 助手 (80159029)
衛藤 義勝 東京慈恵会医科大学, 小児科, 助教授 (50056909)
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| キーワード | アリルサルファターゼA / 酵素精製 / 抗体作成 / CDNAクローニング |
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| 研究概要 |
ヒト肝約1kgよりアリルサルファターゼAを硫安分画、ConAーセファロースカラム、DEAE-Sepharose,C-M Sephadexカラムを用いてアリルサルファターゼAをほぼ5400X倍の精製した。又SDS-ディスク電気泳動法に於て分子量はほぼ54,000と単一のバンドがみられ精製度はほぼ90%以上であった。次に精製したアリルサルファターゼAに対する抗体をマウス脾細胞とミエローマ細胞のハイブリドーマよりELISA、及びWesten Blotting法を用いてArylAモノクローナル抗体を得た。
C-DNAライブラリーは人ヘパトーマCDNAライブラリー(λgt11)をE Coli Y1090にプレート後、アリルA抗体によりスクリーニングした。結果としてIn vitro hybridizationにより6%にELISA陽性性のクローンを得更に組織学的染色法及びWesten Blotting法によりスクリーニングし最終的に1-3クローンを得ることが出来た。
次にアリルAの抗体を用い1×10^64のrecombinaut phageをplaque hybridization法によりスクリーニングし6ケのpositive cloneを得ることが出来た。今後Second Screeningを行いシークエンスを行う予定である。
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