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マメ類種子中に存在するプロテアーゼインヒビターは、タンパク質化学の側面から研究が進んでいるが、CDNA遺伝子を単離しタンパク質への発現が可能になれば、タンパク質工学技術を利用して、さらに詳細な構造と機能の相関を明らかにすることができる。また、インヒビターは種子成熟の一定時期に合成することが明らかにされており、遺伝子の発現調節という観点からも興味深い。本研究では、シカクマメのキモトリプシンインヒビターWCI-3のCDNAをクローニングし、構造解析を進めるとともに、その遺伝子の発現の様相を明らかにすることを目的とする。
開花後35日目のシカクマメ未熟種子をグアニジウムチオシアネートで抽出し、塩化セシウム超遠心沈殿により全RNAを回収し、オリゴαTセルロースでポリ【A^+】RNAを分画した。このポリ【A^+】RNAをウサギ網状赤血球由来の無細胞タンパク合成系で翻訳し、抗WCI-3抗体と反応する産物を分析した結果、ほぼ単一の産物が検出され、WCI-3mRNAの存在が示唆された。この翻訳産物は、精製したWCI-3よりも分子量で約2000大きく、WCI-3は前駆体として生合成され、プロセシングされた後貯蔵されるものと推測された。
この全ポリ【A^+】RNAに対する二本鎖cDNAを、Gubler & Hoffmanの方法を少し改変して合成した。得られた二本鎖cDNA中のEcoRI部位をメチル化した後、両端にEcoRI部位を連結した。これをλgt 10 DNAのEcoRI部位に挿入し、組換え体ファージライブラリーを作製した。合成DNAプローブでスクリーニングし、候補のクローンについて解析を進めている。
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