| 研究概要 |
まず, 仔牛胸腺DNAリガーゼI及びIIに対する抗体を用いた免疫化学的手法によって, 哺乳動物細胞にIとIIの二種類の独立した分子種が存在することを明らかにした. I(分子量20万)が複製用, II(6.8万)が修復用といわれているが確証はなく, 遺伝子レベルで二種類のDNAリガーゼの存在と発現機構を解明することが急務となっている. cDNAクローニングを目指し, まず, 仔牛胸腺より純化したIIのN末端側からのアミノ酸配列の決定を試みたが, N端はブロックされていることが判明した. そこで, リシルエンドペプチダーゼあるいは臭化シアンを用いた方法でペプチドを切断後, 気相シーケンサーで分析したが, IIの量的な問題もあって信頼性のあるデータは得られていない. 現在, さらに改良を加え, 部分アミノ酸配列の解析中である. 又, 最近決定された酵母(S.pombe,S.ceverisiae)のDNAリガーゼ遺伝子の塩基配列中の, 活性中心と予想されるアミノ酸配列に対応する30-merの合成ポリヌクレオチドを用いて, 仔牛胸腺cDNAバンクより, 2つの独立したクローンを得た. pUC系を用いてこれらクローンDNAの塩基配列を解析中である. 構造解析の結果, 酵母リガーゼの活性中心近傍のアミノ酸配列とホモロジーの高い部位が見つかれば, cDNAを大腸菌(JM109)で発現させて, 仔牛胸腺DNAリガーゼに対する抗体で検出する予定である.
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