| 研究概要 |
1.抗体作製:ras蛋白については既に多種の抗体が得られているので, raf蛋白について試みている. これまでに活性rafのプロティンキナーゼ領域を含む32Kdと23Kdの2種の蛋白を大腸菌で発現させることができ, 現在精製を進めている. またBalb/c3T3細胞のraf形質転換株が得られたので, Balb/cマウスで抗raf抗体を産生させる事ができる.
2.条件形質転換:ヒトHーras及びNーras遺伝子をMMTVーLTRに連結し, ホルモンによって形質転換を調節する系を確立できた. ホルモンによる形質転換の出現または消失には1〜3日を要し, ras蛋白発現から開始するカスケードの経時的解析が可能となった.
3.リン酸化蛋白の解析:正常及び7種の癌遺伝子による形質転換3T3細胞を^<32>Pで標識し, 二次元電気泳動でリン酸化蛋白を解析したところ, Hーrasやrafの形質転換細胞ではプロテインキナーゼCの活性が低下していることが示唆された. この事はホルボールエステル(TPA)によるcーfosmRNA誘導能の低下でも裏づけられた. 現在TPA処理と条件形質転換系を併用して, リン酸化蛋白の更に詳細な分析と, Cキナーゼや内在性LTR配列などの転写動態を分析しつつある.
4.フラットリバータント:rasまたはraf癌遺伝子を保持しつつも非形質転換の表現型を示す変異株が得られた. 例えばraf形質転換株由来の変異剤による復帰変異株RSは種々の活性癌遺伝子によって再形質転換されないが, 正常NIH3T3と細胞融合させるとフォーカスを形成する. ヒトDNA移入によってこれに関連する遺伝子の分離を試みたい. またNーras形質転換細胞にヒトDNAを移入して, ヒトDNA配列と活性Nーras遺伝子双方を保持しているフラットリバータントが, 少なくとも3株得られた. 第2代リバータントを分離して, Nーrasの作用を抑制すると思われるヒトの遺伝子を同定分離したいと考えている.
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