| 研究課題/領域番号 |
62440002
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| 研究機関 | 東京大学 |
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研究代表者 |
宮地 重遠 東京大学, 応用微生物研究所, 教授 (40013312)
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| 研究分担者 |
三原 佐代子 東京大学, 応用微生物研究所, 教務職員 (70107449)
福澤 秀哉 東京大学, 応用微生物研究所, 助手 (30183924)
鳥山 尚志 東京大学, 応用微生物研究所, 助教授 (40013338)
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| キーワード | カーボニックアンヒドラーゼ / サブユニット構造 / 無機炭素濃縮 / クラミドモナス / アナシスティス / 高CO_2要求性突然変異株 / カーボニックアンヒドラーゼ遺伝子 |
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| 研究概要 |
1(1)クラミドモナスカーボニックアンヒドラーゼ(CA)は、分子量の異なる2種のサブユニット(A;35kDa及びB;4kDa)が互いにSーS結合したヘテロ4量体であること、また活性に必要な亜鉛イオンをホロ酵素当り2個含むことを明らかにした。さらにBサブユニットの全アミノ酸配列を決定したところ、動物CAI型酵素のC末端領域と有意な相同性をもつことが明らかになった。
(2)除糖したCAに対する抗体をアフィニティークロマトグラフィーにより精製し、ウエスタンブロット法で酵素タンパク質量の変動を調べたところ、CAの誘導にはCO_2濃度変化だけではなく光が必要であることを明らかにした。
(3)CAタンパク質の亜鉛結合部位を含むペプチドのアミノ酸配列に基づいて合成したオリゴヌクレオチドプローブによりゲノムライブラリーをスクリーニングし、8種の組換え体を得た。このプローブはクラミドモナスゲノム上の2ケ所にハイブリダイズすることから、CA遺伝子は2個存在することが示唆された。実際、得られた組換え体には、CA遺伝子を2個含むものが存在した。
2 ラン藻(アナシスティス)の無機炭素濃縮機構に関しては、高CO_2要求性温度感受性突然変異株に野性株のゲノムDNAを導入したところ、相補が起こり、低CO_2条件下でも生育する株が単離できた。ゲノムDNAを制限酵素EcoRIで切断しても相補が起こったので、変異を相補するDNA断片がEcoRIで切断しても相補が起こったので、変異を相補するDNA断片がEcoRIでクローン化できると考えられた。
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