フォンビルブラント因子の構造解析を中心とした血小板凝集に関する研究

1987 年度 実績報告書

• 研究課題/領域番号: 62440087
• 研究機関: 藤田学園保健衛生大学
• 研究代表者: 千谷 晃一 藤田学園保健衛生大学, 医学部, 教授 (60179942)
• 研究分担者: 藤村 吉博 奈良県立医科大学, 輸血部, 助教授 (80118033) ; 小山 文隆 藤田学園保健衛生大学, 医学部, 助手 (40194641) ; 関口 清俊 藤田学園保健衛生大学, 医学部, 講師 (50187845) ; 水落 次男 藤田学園保健衛生大学, 医学部, 助教授 (90133149)
• キーワード: フォンビルラント因子 / 血小板凝集 / 血小板膜糖タンパク質 / 血液凝固第VIII因子結合ドメイン / ヘパリン結合ドメイン / コラーゲン結合ドメイン / アスパラギン結合糖鎖 / トレオニン / セリン結合糖鎖

研究概要

1.大量精製法の改良:ヒトフォンビルブラント因子(VWF)の従来の精製法に検討を加え, 抗体カラムを用いた迅速かつ高収量の精製法を確立した.
2.糖鎖構造の決定:全アミノ酸配列決定の結果, ヒトVWFにはサブコニット当り12個のアスパラギン結合糖鎖と10個のトレオニン/セリン結合糖鎖の存在することが判明した. 本年度はヒトVWFをヒドラジンで分解してアスパラギン糖鎖を遊離させ, 3Hで標識したのち, レクチンカラム, エキソゴリコシダーゼ, ゲル濾過法などを用いて解析した. その結果, 既に報告されている2本鎖, 4本鎖複合型糖鎖の他に, 新たに3本鎖複合型糖鎖, 混成型糖鎖, bisectーGlcNAcを持つ糖鎖などが見つかり, かなり複雑なミクロヘテロゲナイティーの存在することが明らかになった.
3.機能ドメインの同定:VWF血小板膜糖タンパク質(GP)Ib, 同IIb/IIIa,コラーゲン, ヘパリン, 血液凝固第VIII因子などと結合する多機能タンパク質である. 本年度はトリプシンによる限定分解が得られ, GPIbおよびコラーゲンとの結合部位を含むことが明らかにされた52/48kDaフラグメント(残量449ー728)がさらに強いヘパリン結合能を持つこと, 又同じくトリプシンにより限定分解で得られる30kDaフラグメント(残基1ー272)に血液凝固第VIII因子との結合部位の存在することを明らかにした.
4.ジスルヒド結合の決定:2050残基から構成されるVWFサブユニットは169残基の半シスチンを含み, それらは全てサブユニット内ないしサブユニット間ジスルヒド結合に関与している. 本年度はそれらジスルヒド結合位置の約半数を決定し, 3次構造に関する有益な知見を得た.
5.今後の課題:上記3.の知見に基づき, VWFの各種機能ドメインをcDNA発現ベクターを用いて大腸菌あるいは動物細胞で発現させ, それらの生理活性を解析する.

研究成果

• [文献書誌] Y. Fujimura et al.: J. Biol. Chem.262. 1734-1739 (1987)
• [文献書誌] S. D. Berkowitz et al.: J. Clin. Innvest.79. 524-531 (1987)
• [文献書誌] P. A. Foster et al.: j. Biol. Chem.262. 8443-8446 (1987)
• [文献書誌] K. Titani et al.: Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 84. 5610-5614 (1987)
• [文献書誌] T. Marti et al.: Biochemistry. 26. 8099-8109 (1987)
• [文献書誌] K. Titani et al.: Trens in Biochemical Sciences (TIBS). (1988)
• [文献書誌] K.A.Walsh ed. K. Titani: "Methods in Protein Sequence Analysis 1986 Human von Willebrand Factor and the Problems in Squence Analysis of a 280 k Dalton Protein" The Humana Press, New Jersey, 658(171-187) (1987)
• [文献書誌] T.S.Zimmerman Z Z M Ruggeri eds. K. Titani et al.: "Coagulation and Bleeding Disorders, the Role of Factor VIII and Von Willebrand Factor Primary Structor of Human von Willebrand Factor" Marcel dekker, New York, (1988)