| 研究課題/領域番号 |
62440091
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| 研究機関 | 京都大学 |
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研究代表者 |
大西 俊一 京都大学, 理学部, 教授 (00025272)
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| 研究分担者 |
佐藤 智 京都大学, 理学部, 助手 (30183049)
伊藤 忠直 京都大学, 理学部, 助教授 (90093187)
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| キーワード | エンドサイトーシス / エンドソーム / 細胞内輸送 / 細胞内選別 / 単クローン抗体 / 高磁場勾配分離 |
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| 研究概要 |
ラット肝に脂質でコートしたフェライトリガンドを灌流法により、5分間パルス的に投与し、一定時間後に高磁場勾配分画法により、リガンドを含むエンドサイティックベシクルを分離した。分離したエンドサイティックベシクル分画をさらにパーコール密度勾配遠心にかけ、次の知見を得た。1)灌流開始から15分後までは、分離されたエンドサイティックベシクルは比重1.05付近にリソソーム酵素活性をもたない単一のピークを形成した。これはエンドソーム分画であると考えられる。30分後から、比重1.12付近にリソソーム酵素活性をもつ第二のピークが含まれるようになり、それが時間と共に増加した。これはリガンドの輸送先であるリソソーム分画が、高磁場勾配分画法により補集されるようになったためであろう。2)パーコール密度勾配遠心の条件を変えることにより、15分後に補集されたエンドソーム分画は、2種の異なる分画を含むことが明らかになった。この内、より低密度の分画はアシアロ糖タンパク質受容体を含んでいるが、より高密度の分画は同受容体を含んでいないことが免疫化学的手法によって明らかになった。一方5分後に得られたエンドソーム分画は主として受容体を含む分画よりなっていた。これは受容体とフエライトリガンドとの選別を反映していると思われる。3)受容体を含むエンドソーム分画と含まないエンドソーム分画は、タンパク質の組成が大きく異なっていた。
分離したエンドソーム分画を抗原として単クローン抗体の作成を試み、現在2種のクローンを得た。それらは共にラット由来の培養細胞であるNRK細胞を顆粒状に染色した。精製した抗体のアフィニティーカラムを用いて抗原の精製を行い、一方のクローンは200kd、他方は58kdのタンパク質を抗原とすることが明らかになった。それらのタンパク質の機能について現在実験中である。
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