| 研究概要 |
(1)ヒトアデニル酸キナーゼ遺伝子の設計:ヒトアデニル酸キナーゼ遺伝子の塩基配列は決定されていないので,アミノ酸一次構造をもとに遺伝子設計を行い, その596bp塩基配列を大腸菌に発現させるための構築を行った.
(2)ヒトアデニル酸キナーゼ遺伝子の構築と合成:596塩基対よりなるヒトアデニル酸キナーゼの人工遺伝子を鎖長25〜33の40本のフラグメントに分割合成を行い, C_<18>シリカゲル担体による高速液体クロマトグラフィー(HPLe)により分析, 分取後, イオン交換体を用いたHPLCによって単一に精製した. 本遺伝子は40本のオリゴマーで構製され, これらを4つのセグメントに分けて結合を行った.
(3)ヒトアデニル酸キナーゼの発現ベクターの構築と遺伝子発現:人工合成の本遺伝子を含む発現ベクターpAKを大腸菌HB101株に導入して組み換え体を得た. 形質転換させた大腸菌プラスミドを調製し, 精製したプラスミド DNAをdideoxy法で配列の確認を行った. 菌体タンパク質量の10%発現が得られた. そこで菌体の大量培養により人工合成ヒトアデニル酸キナーゼを抽出精製した. 得られた酵素タンパク質の活性は報告されているヒト骨格筋酵素のネーティブな活性値に等しく, 活性化エネルギー, 至適pH, 反応速度論的データ(Km^<ADP>,Km^<ATP>,Km^<AMP>,V^fmax,V^rmax)もネーティブな酵素の特性に近いものが得られていることが確認された.
(4)アデニル酸キナーゼ対様型とモノクローナル抗体による識別:ブタ骨格筋酵素標品に対するモノクローナル抗体を常法によりマウスで産出し, 本酵素アイソザイムの泳動ゲル面タンパク質を転写したニトロセルロース膜上でアビジンービオチン法によって免疫染色を行った. この為, 特異モノクローナル抗体をtoolとした本酵素アイソザイムの分別定量法への手がかりが得られた. 次年度は本症の変異型本酵素との構造比較を行う.
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