ヒトDuchenne型進行性筋ジストロフィ-症の病因・病態の解明ー特にアデニレ-トキナ-ゼを指標としてー

1989 年度 実績報告書

• 研究課題/領域番号: 62480175
• 研究機関: 宮崎医科大学
• 研究代表者: 濱田 稔 宮崎医科大学, 医学部, 教授 (90039529)
• 研究分担者: 上杉 晴一 大阪大学, 薬学部, 助教授 (70028851) ; 竹中 均 宮崎医科大学, 医学部, 助手 (10179658)
• キーワード: アデニル酸キナ-ゼ / MgATP結合部位 / アミノ酸点変異 / タンパク質工学 / 人工合成遺伝子 / AMP結合部位

研究概要

これまでの2年間に、ヒトアデニル酸キナ-ゼをコ-ドする鎖長596塩基対の人工遺伝子を合成し、天然型およびそのV95F、R97A変換体を大量に産生できる発現系を確立した。両者における酵素化学諸性質、動力学的解析、アミノ酸分析高次構造の比較から、これまでの化学修飾の実験成果からは酵素活性に必須な残基と考えられていたV95とR97は触媒作用に直接的に関与する残基でないことを明らかにした。
続く最終年度において、R44、R97、R123、R132、R138、R149残基をAlanineに換えた変換体遺伝子をカセット変異法、もしくはM13ファ-ジを利用したtemplate-directed mutagenesis法で作製し、変換体遺伝子の発現ベクタ-を保持する大腸菌HB101の形質転換体株からプラスミドDNAを調製して、Sangerらのdideoxy法でそれぞれの塩基配列が正しいことを確認した。目的とする酵素タンパク質は、超音波破砕による大腸菌の可溶性画分をphosphocelluloseとセファデックスGー75の2段階のカラムクロマトによって単一バンドの高純度天然型および変換体を大量に得る方法を確立した。アミノ酸置換による変換体2次構造の変化をCDスペクトルパタ-ンにより天然型との差異がないことを確認してkineticsに関する解析に供した。上記の各ArgをAlaに置換したR44A、R128A、R132A、R138A、R149A変換体酵素の正反応における反応速度定数、km値、触媒効率の変化を調べ,Argー44はAMPを認識し、Argー128はATPの結合に関与するばかりか、さらにArgー132、Argー138、Argー149の3つの残基が酵素活性に必須な残基と考えられることを見出した。また、Aspー119をAsnに置換した変換体D119Nにおいては基質との親和性、触媒能とも大きい変化は観察されなかった。
以上の結果をもとに、これまでの研究成果を合理的に説明できる本酵素の新しい基質結合部位モデルを提示した。これらの事実をもとに筋ジストロフィ-症の変異型本酵素についてさらにその本態を究明したい。

研究成果

• [文献書誌] 濱田稔,竹中均,澄田道博: "アデニル酸キナ-ゼーー構造と機能" 蛋白質・核酸・酵素. 33. 1708-1728 (1988)
• [文献書誌] Kim,H.J.,Nishikawa,S.,Tanaka,T.,Uesugi,S.,Tanaka,H.,Hamada,M.and Kuby,S.A.: "Synthetic genes for human muscle-type adenylate kinase in Escherichia Coli" Protein Engineering. 2. 379-386 (1989)
• [文献書誌] Kuby,S.A.,Hamada,M.,Johnson,M.,Russell,G.A.,Manship,M.,Palmieri,R.H.,Fleming,G.,Bredt,D.and Mildvan,A.S.: "Synthesis and preparation of peptide and fragments of rabbit muscle adenylate kinase and their nucleotide binding properties" J.Protein Chemistry. 8. 549-562 (1989)
• [文献書誌] Kim,H.J.,Nishikawa,S.,Tokutomi,Y.,Takenaka,H.,Hamada,M.,Kuby,S.A.and Uesugi,S.: "In Vitro Mutagenesis studies at the arginine residues of adenylate kinase,A revised finding site for AMP in the X-ray model" Biochemistry. 29. 1107-1111 (1990)
• [文献書誌] Kim,H.J.,Tokutomi,Y.,Nishikawa,S.,Takenaka,H.,Hamada,M.,Kuby,S.A.and Uesugi,S.: "In Vitro mutagenesis of arginine residues at the catalytic cleft of human adenylate kinase" Isoenzymes. (1990)
• [文献書誌] Kurokawa,Y.,Takenaka,H.,Sumida,M.,Oka,K.,Hamada,M.and Kuby,S.A.: "Multiforms of mammalian adenylate kinase and its monoclonal antibody against AK1" Enzymes. (1990)
• [文献書誌] Hamada,M.,Takenaka,H.,Fukumoto,K.,Fukamachi,S.,Yamaguchi,T.,Sumida,M.,Shiosaka,T.,Kurokawa,Y.,Okuda,H.and Kuby,S.A.: "“Isozymes":Current Topics in Biological and Medical Research Vol.16:Agriculture,Physiology and Medicine" Alan R.Liss,Inc.New York(U.S.A.), 19 (1987)
• [文献書誌] Hamada,M.,Takenaka,H.and Sumida,M.: "“A Study of Enzymes",Vol.II Chapter 8,b" CRC Press Inc.Florida(U.S.A.), (1990)