| 研究課題/領域番号 |
62480456
|
|---|
| 研究種目 |
一般研究(B)
|
| 配分区分 | 補助金 |
|---|
| 研究分野 |
代謝生物化学
|
|---|
| 研究機関 | 東京大学 |
|---|
研究代表者 |
川喜田 正夫 東京大学, 教養学部, 教授 (00012740)
|
|---|
| 研究分担者 |
服部 成介 東京大学, 教養学部, 助手 (50143508)
川戸 佳 東京大学, 教養学部, 助教授 (50169736)
|
|---|
| 研究期間 (年度) |
1987 – 1989
|
| キーワード | 筋小胞体 / カルシウム輸送 / ATPア-ゼ / 能動輸送 / Na / Hアンチポ-タ- / イオン輸送 |
|---|
| 研究概要 |
1.骨格筋小胞体Ca^<2+>輸送ATPaseに関して、以下の諸点を明らかにした。(1)筋小胞体膜を直接サ-モリシン消化し、上清に遊離したペプチドをHPLCで分画することにより、非特異的凝集を回避しつつペプチド断片を効率よく精製する方法を開発した。この方法は他の膜タンパク質にも応用が可能である。(2)上記の方法により、IAEDANS、NEM(ANM)がCys674、CYs344/364をそれぞれ特異的に標識することを明らかにした。これらの試薬で蛍光標識したATPaseのナノ秒時間分解蛍光異方性測定を行い、2種類の標識が結合する分子内ドメインの運動性がそれぞれ異なることを明らかにし、Ca輸送反応機構の解明にドメイン間相互作用の理解が重要であることを示した。(4)種々の基質の存在下におけるATPaseのトリプシン限定分解パタ-ンを解析し、さらに限定分解断片を分画、精製してそのN末端およびC末端を解析することにより、Lys218、Lys234、Arg236の近傍を含む領域のトリプシン感受性がCA^<2+>およびAMP-P(NH)Pの結合に伴って著明に変化することを見いだした。この部分のトリプトシン切断によって輸送系の共役機能、反応性は大きく変化する。この部分はCA^<2+>結合ドメインとATP結合ドメインの接触部位と考えられる領域であり、本研究の結果はCa^<2+>輸送反応におけるドメイン間相互作用の役割の一端を明らかにするものである。(5)ATP-ピリドキサ-ルを用いた親和性標識により、Asp351、Lys492、Lys684がATP結合部位内で近接して存在し、Ca^<2+>の結合に伴いこの部分の構造が変化することを明らかにした。(6)スピン標識ATPaseとCa^<2+>の代替イオンGd^<3+>との間の常磁性相互作用の解析を通じて、Ca^<2+>輸送部位がATPaseの膜内領域の、比較的膜面に近い位置に存在することを明らかにした。
2.Na^+/H^+アンチポ-タ-の化溶化再構成系を確立し、ゲルロ過法、DEAE-イオン交換法などにより、ウシ腎刷子縁膜から活性標品を部分精製することに成功した。
|
