| 研究概要 |
本研究の対処バクテリアEnterobacter cloacae AGR7より細胞質遺伝子pAGR7を抽出調製し、大腸筋Escherichia coli C600-1のコンピテンスセルを形質転換し、形質転換体E.coli C600-1/pAGR7を作製した。E.coli C600-1の銀耐性濃度は、形質転換により<20mg/lから1,600mg/lへと80倍以上上昇した。En.cloacae AGR7およびE.coli C600-1/pAGR7は、L培地(バクトトリプトン10g/l、酵母エキス5g/l、食塩5g/l)での継代培養保存中に、銀耐性能および銀蓄積能を保持しているにもかかわらず、両者の細胞質より細胞質遺伝子pAGR7が消失した。安定な銀耐性遺伝因子を保有する細胞質遺伝因子を確保するため、トランスポゾンTn3のin vivo転移の結果生ずる新規分子の作製分離とEn.cloacae pAGR7に存在する銀耐性遺伝因子をコードするDNA断片のpUC18上へのクローニングをすることとした。予備実権として、亜鉛耐性遺伝因子pZNC8が染色体にインテグレートしたE.coli C600-1/gZNC8にTn3を保有するRSF2124を導入し、プロロングド培養を12回継続した。その結果、亜鉛耐性遺伝因子を有する新規の細胞質遺伝因子がin vivoで発生し、Tn3の応用が確認された。同様の走査をE.coli C600-1/pAGR7に対して行ったが、E.coli C600-1/pAGR7では新規の細胞質遺伝因子は発生しなかった。次いで、En.cloacae pAGR7のDNAをBamHI、SacI、SalIで分解し、pUC18とライゲーションし、E.coli JM109のコンピーテンスセルを形質転換した。X-gal、IPTGそしてAgを含むプレート上で確認した約15,000個のコロニーより、66個のコロニーが200mg/lの銀を含むプレート上で生育した。これらはすべて、銀40mg/lを含む液体培地では増殖することはなく、インタクトなpAGR7による形質転換体での銀耐性発現とは、その効率が異なっていた。
|
