| 研究概要 |
1.ニジュウヤホシテントウムシ(Henosepilachana vigintioctopunctata-Hと略)及びカズキダニ(Ornithodoros moubata-Omと略)を用いて, 卵黄タンパク質の前駆体ヴィテロジェニン(Vitellogenin-Vgと略)の脂肪体より6MグアニジンイソチオシアネートによりRNAを抽出し, 5.7MCsClに上層して超遠心分離によりRNase-freeのtotal RNAを調製した.
2.total RNA標品よりOligo-dTセルロースカラムによってpolyA(+)RNAを分離しin vitroトランスレーション系によって翻訳させ, Hv及びOmのVgが合成されることを抗Hv-Vg血清及び抗Om-Vg血清を用いて確認し, 得られたpolyA(+)RNAがHv, Om共に完全なmRNAを含む標品であることを明らかにした.
3.このpolyA(+)RNAを発現リンカーを用いたOkayama-Berg法によりcDNAを合成してベクター内に組み込み, 大腸菌JM109株にトランスフォームしてHv,OmそれぞれのVgcDNAライブラリーを作製した.
4.このライブラリーより抗Hv-Vg及び抗Om-Vg血清を用いてHv, Om-Vgを発現しているクローンを酵素抗体法によりスクリーニングし, Hvについては23個, Omについては2個positiveなクローンの分離に成功した.
5.現在これらのクローンについてインサートのサイズの検討・制限酵素地図の作製を実施中である.
6.また完全長cDNAクローンを得るため継続してスクリーニングを行なうと共に, Nothern,Southern Blotting用プローブの作製を行ない, 幼若ホルモンによるHv-VgmRNA及び吸血刺激によるOm-VgmRNAの定量解析を行なっている.
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