| 研究概要 |
本研究ではBacillus amyloliquefaciensより分離したpFTB14プラスミドを用いて, Bacillus属プラスミドの事故複製機構を解明し, その結果をコピー数制御可能なベクタープラスミドの開発に応用することを目的とした.
pFTB14の自己複製には1526bpからなるプラスミドDNA断片が必須であり, その塩基配列から, 複製に関与する蛋白(rep)の存在が示唆されている. そこでこのrep蛋白の機能を遺伝学的に検討した. 決失および挿入変異のプラスミドの性質から, このDNA断片には, 複製開始点と考えられる領域およびトランスに機能する分子量39,600repタンパクをコードする領域が含まれることが明らかになった.
次にゲルシフト分析方を用いて, このrepタンパクとDNAとの相互作用を検討した. 入ファージ由来の温度感受生プロモーターシステムを用いて, 大腸菌内でrepタンパクを著量生産させ, DEAEセルロースカラムクロマトにより部分精製した. 部分精製したrepタンパクと, 複製開始点を含むと考えられる^<32>P-DNA断片, および非特異的吸着を除くための入ファージDNAを混合し, 高イオン強度緩衝液系による5%ポリアクリルアミドゲル電気泳動を行い, オートラジオグラムによりDNA断片の移動を調べた. その結果, repタンパクは複製開始点を含むと考えられたDNA領域と結合することが明らかとなった. この領域には, 枯草菌内で複製可能なStaphylococus由来のプラスミド, puUB101, pC194などで複製開始点と考えられている塩基配列と共通な配列が認められた. またrepタンパクのアミノ酸配列は, pUB110, pC194の複製に必須と考えられているタンパクのアミノ酸配列と40〜50%の高い相同生を示した. 以上の結果より, 本プラスミド上にコードされるrepタンパクは, トランスに働き, プラスミド複製開始点に作用し, プラスミドDNAの複製を制御していると推察された.
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