| 研究概要 |
本研究ではBacillus amyloliquefaciensより分離した潜在性、低コピープラスミド、pFTB14(分子量、5.3Md)を用いて、Bacillus属プラスミドの自己複製機構を解明し、その結果をコピー数制御可能なベクタープラスミドの開発に応用することを目的とした。
pFTB14の自己複製には、1526bpからなる領域が必須であり、かつ充分であること、この領域に1017bpからなるオープンリーデングフレーム(ORF)およびそのプロモータ配列が存在することを明らかにして来た。さらにORFから推定されるタンパク(repタンパク)の性質を遺伝学的に検討し、このタンパクは複製に必須であり、また相補試験によりrepタンパクは複製起点と推定される領域に対してトランスに機能することを明らかにした。
本年度はこのタンパクの性質をさらに明らかにするため解析をすすめpFTB14のrepタンパクと複製開始領域と考えられるDNAとの相互作用を検討した。入ファージ由来のプロモータシステムを用い、大腸菌内でrepタンパクを著量生産し、部分精製した。得られたrepタンパクの分子量は約39,600であり、塩基配列から推定されたものと一致した。ゲルシフトアッセイを行ったところ、repタンパクと複製開始DNA領域が結合することが明らかとなった。また複製起点と考えられる領域を解析したところ、Staphylococcus由来のプラスミド、pUB101やpC194の複製起点と推察されている塩基配列と相同な配列が認められた。以上の結果より、本プラスミド上にコードされているrepタンパクはプラスミド複製開始点に作用し、自己複製を制限していると推察された。また染色体DNAの複製に関与する遺伝子との相補性を検討したが顕著な関係は認められなかった。
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