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1.ヒト赤血球から、エステラーゼDー1とDー2を高度に精製し、その性質を調べた。
2.精製エステラーゼDー1に対するウサギ抗体を作成し、生じた抗体がエステラーゼDに対して特異的に反応することをウェスタンブロット法で確かめた。
3.精製エステラーゼDー1標品を、タンパク質分解酵素で消化後、高速液体クロマトグラフィーでペプチドを分取し、9個のペプチドについて、そのアミノ酸配列を決定した。
4.2.で得た抗体を使って、ヒト胎盤λgt_<11>cDNAライブラリーをスクリーニングし、ポジティブクローンを得た。
5.ポジティブファージクローンを増やし、cDNA部分を切り出して、pUC9へサブクローン化した。
6.得られたcDNAの大きさは、約300塩基対で、ジデオキシ法で決定した塩基配列の中に、3で得られたペプチドのアミノ酸配列に相当する部分が含まれていた。
7.さらに長いcDNAを含むクローンを入手すべく、再度ヒト胎盤λgt_<11>cDNAライブラリーをスクリーニングした所、約1200塩基対を含むcDNAクローンが得られた。
8.このcDNAについて塩基配列を求めた所、5′ー末端部分にタンパク合成の開始コードンであるメチオニンが含まれていなかったので、cDNAの5′ー末端側部分をプローブとして、再度ヒト胎盤λgt_<11>cDNAライブラリーをスクリーニングしている。
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