| 研究概要 |
本年度の研究において, (1)ヒト肝癌由来培養細胞(Hep G2)の培養系の確立, (2)血清中のプロアポA-I変換酵素活性測定のための基質となる標識プロアポA-Iの合成, を行った.
Hep G2細胞はAmerican Type Culture Collectionより購入した. 培養はT25フラスコを用い, 10%FBSを加えたMEMで行った. アポ蛋白の合成実験は90〜95%confluent cell(3×10^6 cells)を用い, FBS free MEMで培養後, 培養液を採取し, 10〜20倍に濃縮して以下の測定を行った. 培養液中の主な分泌蛋白はアルブミンであり, 培養48時間までは, 直線的に増加した. アポA-Iの分泌量はアルブミンの約1/5であった. 培養液中にはアポA-II, アポB, アポEなどが免疫化学的に証明できた. 48時間後の分泌量はアルブミン, アポA-I, アポB, アポA-IIの順であり, アポEの分泌量はアポA-IIと同程度であった.
濃縮培養液の等電点電気泳動とSDS-PAGEによる二次元電気泳動でアポA-Iを検討してみると, かなりのアポA-IがプロアポA-Iとして存在することが示された. 特に, 6時間および12時間培養では, 大部分がプロアポA-Iであった. プロアポA-I変換酵素活性測定の基質となる^3H標識プロアポA-Iの作製は, 培養液中に^3H-phenylalanineを加えて12時間培養した. アポA-Iの分離は抗アポA-I抗体結合セファロース4Bを用いたimmunoaffinityにより行った. さらにアポA-IからのプロアポA-Iの分離は, SDS-PAGEにより行い, ゲルを5mm間隔で切断し, アポ蛋白を溶出し, プロアポA-Iを回収した.
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